新型STAT3抑制劑齊福斯尼對多發(fā)性骨髓瘤的臨床前治療作用及其機理研究.pdf

1、研究背景和目的：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子-3（Signal Transducer and Activator of Transcription-3，STAT3）是一個可以被不同的細(xì)胞因子受體激活的轉(zhuǎn)錄因子，與細(xì)胞的增殖、生存、血管生成以及遷移等密切關(guān)聯(lián)。STAT3在多種腫瘤細(xì)胞（包括白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤等血液腫瘤以及肺癌、乳腺癌、前列腺癌等多種實體腫瘤）中表達異常升高，與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。而抑制STAT3活性，則癌細(xì)胞

2、出現(xiàn)凋亡。最近的研究發(fā)現(xiàn)，抑制STAT3信號通路可以克服包括視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、肺癌、白血病等多種腫瘤的化學(xué)耐藥性。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)了一個可以抑制STAT3激活的小分子化合物Kifocitanib-齊福斯尼。因此，本課題旨在明確Kifocitanib對多發(fā)性骨髓瘤的作用，并揭示其作用機理。
　　研究方法：
　?。?）利用臺盼藍染色排除法，檢測Kifocitanib對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的存活率及增殖的影響；
　?。?）流

3、式細(xì)胞術(shù)檢測Kifocitanib對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響；
　?。?）用Western blotting技術(shù)檢測與細(xì)胞凋亡及周期相關(guān)蛋白的表達水平；檢測與STAT3信號通路相關(guān)的蛋白質(zhì)表達水平；
　?。?）用免疫熒光染色方法檢測p-STAT3蛋白的表達及定位；
　　（5）細(xì)胞劃痕實驗檢測 Kifocitanib對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）遷移的影響；
　　（6）動物實驗：構(gòu)建骨髓瘤的裸鼠異種移

4、植腫瘤模型，檢測Kifocitanib對裸鼠腫瘤體積大小及裸鼠體重的影響，同時觀察Kifocitanib對裸鼠有無毒性作用。
　　研究結(jié)果：
　?。?）Kifocitanib對多種腫瘤細(xì)胞的增殖具有抑制作用。分別選用了六種多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞,對細(xì)胞存活和增殖狀況的分析表明，KIF對這些細(xì)胞的增殖均呈現(xiàn)劑量依賴性的抑制作用。
　?。?）Kifocitanib誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡。通過Annexin V-FITC和PI雙

5、染，流式檢測發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞所占的比例依濃度升高而顯著升高。Western blotting檢測結(jié)果表明，促進了caspase-3和caspase-9的裂解激活，并活化了PARP。另外，它對凋亡抑制蛋白XIAP的表達也有抑制作用。
　　(3) Kifocitanib影響了細(xì)胞周期的進程。應(yīng)用Western blotting檢測多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白，包括多種Cyclins、CDK4、6、E2F-1和 p-RB。結(jié)果顯示Kifo

6、citanib均下調(diào)了這些蛋白的表達，并呈濃度依賴性；進一步應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在G0/G1期所占比例隨藥物濃度的增加而增多。
　?。?）Kifocitanib抑制了STAT3的活化。Western blot檢測表明，Kifocitanib對多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞STAT3內(nèi)源性活化和白介素-6（IL-6）刺激引起的STAT3的外源性活化均有抑制作用。免疫熒光染色檢測RPMI-8226細(xì)胞中p-STAT3的表達，同樣證實Kifo

7、citanib對其活化有抑制作用。骨髓基質(zhì)細(xì)胞（HS-5）和骨髓瘤細(xì)胞（OPM2 and U266）共培養(yǎng)條件下，Kifocitanib也對STAT3的活化有抑制作用。
　?。?）Kifocitanib阻礙了STAT3的核輸出。分離RPMI-8226細(xì)胞的胞核、胞漿，分別檢測給藥后STAT3的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不論是在全培養(yǎng)條件下還是饑餓時，給藥后STAT3在胞核中水平升高，提示Kifocitanib阻礙了STAT3的核輸出。

8、>　?。?）Kifocitanib抑制了STAT3信號通路的進行。通過對STAT3上、下游信號的激活情況的檢測表明，Kifocitanib抑制了STAT3上游JAK2、c-Src的磷酸化水平，并下調(diào)了下游靶蛋白（Mcl-1、Bcl-2、CCND2、VEGF等）的表達。
　?。?）Kifocitanib抑制了細(xì)胞的遷移。選用人血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）為研究對象，采用細(xì)胞劃痕實驗方法檢測證實，Kifocitanib能明顯抑制細(xì)胞的遷

9、移。
　?。?）Kifocitanib抑制了體內(nèi)腫瘤的生長。我們構(gòu)建了一個裸鼠體內(nèi)骨髓瘤的異種移植模型，通過14天連續(xù)給藥對其腫瘤體積大小和體重的監(jiān)測發(fā)現(xiàn)， Kifocitanib能明顯抑制腫瘤的生長，而對其體重?zé)o明顯影響。Kifocitanib也抑制了腫瘤組織中STAT3的表達及其活化。
　　結(jié)論：我們在國內(nèi)外最先發(fā)現(xiàn) Kifocitanib具有抗多發(fā)性骨髓瘤的活性，其通過抑制 STAT3的活化來引起下游靶基因蛋白表達抑制