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文檔簡介
1、目的:研究不同來源成骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的形態(tài)特征和生物學(xué)活性,探討成骨細(xì)胞分離培養(yǎng)的最佳方法及作為骨組織工程種子細(xì)胞的可行性和應(yīng)用價值,為骨組織工程的研究提供穩(wěn)定可靠的種子細(xì)胞來源。方法:無菌條件下取新生新西蘭兔脛骨骨膜和骨髓,PBS沖洗3次,0.25%胰蛋白酶消化20分鐘,以徹底去除殘留在組織塊上的血污,再將骨膜剪成大小約為1×1mm的組織塊,將骨膜組織塊放入25ml培養(yǎng)瓶中,加入含10%小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液2ml,細(xì)胞長滿瓶底后
2、進(jìn)行傳代培養(yǎng)。注射器肝素化后抽取完全DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔,將混合DMEM培養(yǎng)液加入到無菌離心管內(nèi),1000轉(zhuǎn)/分鐘離心,去除最上面的脂肪層,以1×106/cm2密度接種于100ml培養(yǎng)瓶中進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。3天后全量換液,細(xì)胞匯合成單層后用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。細(xì)胞傳代后改用含地塞米松(1×10-8mol/l)、β-甘油磷酸鈉(10mmol/l)、維生素C(50mg/ml)的條件培養(yǎng)液培養(yǎng)。取第5代生長旺盛的成骨細(xì)
3、胞,胰蛋白酶消化后,以107/ml的濃度封入凍存管進(jìn)行超低溫凍存,一個月后復(fù)蘇,以106/ml的濃度接種在含有5mlDMEM培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。每種方法培養(yǎng)的細(xì)胞每日在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài),通過Gomori鈣鈷法進(jìn)行堿性磷酸酶染色,vonKossa法進(jìn)行鈣結(jié)節(jié)染色,觀察細(xì)胞體外基質(zhì)分泌和骨化過程。 結(jié)果:骨膜培養(yǎng)第3天可見少量的梭形細(xì)胞從組織塊周圍游出,隨培養(yǎng)時間延長細(xì)胞數(shù)量逐漸增多,圍繞組織塊周圍呈放射狀生長,10天時
4、細(xì)胞融合成單層。傳代后的細(xì)胞呈梭形、多角形,帶有粗大的突起,4天時融合成單層。組織塊培養(yǎng)的原代和傳代細(xì)胞均有活躍的增殖能力,堿性磷酸酶染色及鈣結(jié)節(jié)染色陽性。骨髓培養(yǎng)剛接種時細(xì)胞呈球形懸浮于培養(yǎng)液中,4~5天時貼壁細(xì)胞開始增殖呈克隆樣生長,10~12天細(xì)胞長滿瓶底。細(xì)胞傳代后5天匯合成單層,細(xì)胞增殖旺盛,骨髓培養(yǎng)的原代細(xì)胞堿性磷酸酶染色陽性率低于傳代后細(xì)胞的陽性率。傳代細(xì)胞堿性磷酸酶染色陽性率高,鈣結(jié)節(jié)染色呈陽性。 結(jié)論:兩種來源
5、的細(xì)胞均表現(xiàn)典型成骨細(xì)胞的形態(tài)特征和較強(qiáng)的生物學(xué)活性,均可作為骨組織工程種子細(xì)胞的可靠來源。細(xì)胞凍存復(fù)蘇后形態(tài)特征和生物學(xué)活性變化不大,可作為保存細(xì)胞的一種方法。 目的觀察成骨細(xì)胞同種異體移植的成骨情況及免疫反應(yīng),比較凍存成骨細(xì)胞和未凍存細(xì)胞在成骨能力和免疫原性方面的差異,探討同種異體成骨細(xì)胞移植的可行性,為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)。 方法取新生新西蘭大白兔脛骨骨髓,分離后加入條件培養(yǎng)液體外培養(yǎng)原代成骨細(xì)胞,細(xì)胞傳代后,對細(xì)
6、胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)、堿性磷酸酶(ALP)染色及體外礦化能力的檢測。取第5代生長旺盛的細(xì)胞一部分進(jìn)行動物體內(nèi)試驗,另一部分采用超低溫凍存的方法保存,1個月后復(fù)蘇,取復(fù)蘇后生長旺盛的細(xì)胞進(jìn)行動物實驗,與未凍存細(xì)胞在成骨情況、免疫反應(yīng)方面進(jìn)行比較。將凍存和未凍存的兩種細(xì)胞以2×107/ml濃度分別與磷酸三鈣(TCP)復(fù)合,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),3天后用于植入動物實驗。30只新西蘭大白兔為移植受體,隨機(jī)分為A、B、C三組,將兩種復(fù)合體和
7、單純TCP材料分別植入到兔腹直肌肌袋內(nèi),每組10只,共三組,A組(凍存細(xì)胞組)、B組(未凍存細(xì)胞組)、C組(單純材料組)。術(shù)后第1、2、4、8、12周分別取標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)觀察、血清特異性抗體檢測、淋巴細(xì)胞增殖試驗和淋巴細(xì)胞毒試驗。 結(jié)果實驗組各兔移植術(shù)后無一例發(fā)生感染,切口均為一期愈合,未見明顯全身及局部排斥反應(yīng),A、B兩組移植后第2、4周檢測到特異性抗體,8周時已檢測不到特異性抗體,細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒反應(yīng)和淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)于術(shù)后
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