LPS聯(lián)合恩諾沙星致雞肝細胞損傷模型的建立及復方甘草酸單胺保護機理研究.pdf

1、家禽細菌感染性疾病防治過程中常需使用抗菌藥物，而殺菌型抗菌藥往往誘導革蘭氏陰性菌釋放內毒素。內毒素、抗菌藥物皆可誘發(fā)肝損傷，二者共同刺激致肝損傷的病理演變規(guī)律及藥物修復機理亟待探明。本文在內毒素、恩諾沙星單獨誘發(fā)雞肝細胞損傷基礎上，建立內毒素與恩諾沙星聯(lián)合誘發(fā)新型復合式肝細胞損傷模型，并藉此研究其病理發(fā)生發(fā)展及復方甘草酸單胺的保護作用及機理。主要研究內容和結果如下:
　　1、雞肝細胞分離及原代培養(yǎng)方法的建立
　　采用半原位兩

2、步灌流法，對40-50日齡的海藍公雞進行肝細胞分離，臺盼藍拒染法計算肝細胞存活率和細胞總數(shù)。肝細胞以5×105 cell/ml接種于6孔細胞培養(yǎng)板，每孔3ml，含10％胎牛血清Williams'mediumE培養(yǎng)基中，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。觀察細胞形態(tài)，測定不同培養(yǎng)階段細胞培養(yǎng)上清液中乳酸脫氫酶(LDH)活力。結果顯示，肝細胞存活率≥95％，肝細胞產量為（4.1±0.2）×108cell/肝;培養(yǎng)48 h至144h，細胞上清液中LDH活力在

3、低水平下保持穩(wěn)定，細胞可維持良好的生長狀態(tài)達7天以上。
　　2、LPS聯(lián)合恩諾沙星誘導雞肝細胞損傷體外模型的建立
　　2.1 LPS、恩諾沙星致肝細胞損傷劑量的篩選取上述分離培養(yǎng)48h肝細胞，進行以下實驗。LPS組分別用濃度為0（對照）、10、20、30、40、50、60、80、100μg/ml的LPS損傷肝細胞(n=3);恩諾沙星組分別用濃度為0（對照）、100、120、140、160、180、200、220、240μg/

4、ml的恩諾沙星損傷肝細胞(n=3)。24h后，檢測肝細胞存活率，上清液ALT、AST活性，篩選致肝細胞損傷的較佳劑量。結果顯示:與對照組相比，隨LPS、恩諾沙星濃度增加，肝細胞存活率與ALT、AST呈劑量依賴性下降和上升。其中，10、20、30、40、50μg/ml的LPS組肝損傷不明顯，60、80、100μg/mlLPS組肝細胞存活率極顯著降低(p＜0.01)，ALT、AST活性極顯著升高(p＜0.01);100、120、140、16

5、0μg/ml的恩諾沙星對肝細胞損傷不明顯，而180、200、220、240μg/ml恩諾沙星肝細胞存活率極顯著降低(p＜0.01)，ALT、AST活性極顯著升高(p＜0.01)。故確定LPS劑量60μg/ml、恩諾沙星劑量180μg/ml為各自致肝細胞損傷最佳劑量。
　　2.2 LPS聯(lián)合恩諾沙星致雞肝細胞體外損傷模型的建立在2.1基礎上，取正常培養(yǎng)48h的肝細胞，進行LPS聯(lián)合恩諾沙星致肝細胞損傷相互影響的研究。用含0（對照）、

6、30+40、30+60、30+80、30+100、30+120μg/mlLPS+恩諾沙星的生長培養(yǎng)液換液(n=3)，培養(yǎng)24h后，檢測肝細胞存活率，上清液ALT、AST活性。結果顯示:與對照組相比，隨LPS中添加的恩諾沙星劑量的增加，肝細胞損傷程度相應加大。其中30μg/mlLPS+80μg/ml恩諾沙星使肝細胞存活率下降50％，ALT、AST活性極顯著升高(P＜0.01)，故確定該組合濃度作為新型復合式肝細胞損傷最佳造模劑量。

7、　　3、復方甘草酸單胺對LPS聯(lián)合恩諾沙星致肝細胞損傷的保護機理研究
　　取培養(yǎng)48h肝細胞，對照組:生長培養(yǎng)液換液(n=3)。模型組:含30+80μg/ml LPS+恩諾沙星的生長培養(yǎng)液換液(n=3);治療組:以30+80μg/ml LPS+恩諾沙星致肝細胞損傷24h后，用含CAG濃度為25、50、100、200、400μg/ml的生長培養(yǎng)液換液(n=3)。各組換液處理后均繼續(xù)培養(yǎng)24h，進行以下試驗:
　　3.1復方甘草

8、酸單胺對肝細胞保護和抗氧化作用檢測肝細胞培養(yǎng)上清液和勻漿液中ALT、AST、SOD、GSH、MDA等生化指標的含量及肝細胞存活率來研究復方甘草酸單胺對LPS聯(lián)合恩諾沙星誘導的肝細胞損傷的保護和抗氧化作用。結果顯示:復方甘草酸單胺可抑制LPS聯(lián)合恩諾沙星損傷引起的ALT、AST活性和MDA含量的升高(p＜0.05)，顯著提高SOD、GSH及肝細胞存活率(p＜0.05)。該結果表明:復方甘草酸單胺對雞肝細胞有保護作用，該保護作用可能與其抗氧

9、化，清除自由基能力有關。
　　3.2復方甘草酸單胺對肝細胞凋亡損傷的影響流式細胞儀檢測肝細胞早期凋亡比率，熒光定量PCR檢測Caspase-3，Bax，Bcl-2，F(xiàn)as mRNA表達水平。結果顯示:復方甘草酸單胺可顯著抑制由LPS聯(lián)合恩諾沙星損傷引起的細胞早期凋亡比率增加;與對照組比較，模型組細胞Bcl-2 mRNA表達降低，Caspase-3，Bax，F(xiàn)as mRNA表達顯著升高。復方甘草酸單胺可一定程度上減輕Bcl-2 mR