兩種含SV40T不同區(qū)段的基因構建及其轉(zhuǎn)基因小鼠的建立.pdf

1、該試驗為了細致研究SV40T致瘤過程中Rb、p53基因的具體作用,構建了兩種含有SV40T不同區(qū)段的外源基因:Rb結合域點突變的SV40T基因(SV40T-DRb)和無p53結合域的SV40T基因(SV40T-Dp53).建立這兩種基因的轉(zhuǎn)基因小鼠,為探討SV40T致瘤過程中p53和Rb的作用提供工具.試驗成果如下:1.利用分子生物學的基因克隆手段,將改造的SV40T基因片段克隆測序.SV40T-DRb基因的測序結果表明,在位于Rb結合

2、域中的第109位氨基酸發(fā)生了突變(E→V),其它氨基酸則無變化.SV40-Dp53基因的測序結果表明,與正?；蚝塑账釋Ρ鹊耐葱赃_98％.2.將測序后的SV40T-DRb基因和SV40T-Dp53基因克隆進乳腺特異性表達載體p205C3中,運用雄原核顯微注射法制備轉(zhuǎn)基因小鼠.先后共計注射862枚小鼠受精卵,移植360枚注射后存活的小鼠受精卵,使用35只假孕受體母鼠,有23只受孕,共出生127只小鼠.3.轉(zhuǎn)基因小鼠出生后,用PCR方法檢

3、測出6只雙陽性轉(zhuǎn)基因(同時檢測到SV40T-DRb和SV40T-Dp53兩種基因)小鼠,為了避免PCR技術造成的假陽性,用Southern blot方法檢測出1只雙陽性轉(zhuǎn)基因小鼠(♂).4.F<,0>代轉(zhuǎn)基因小鼠繁殖交配后,獲得25只F<,1>代小鼠,經(jīng)PCR檢測證明轉(zhuǎn)基因攜帶率為50％(16/25),符合孟德爾遺傳規(guī)律,證明外源基因可穩(wěn)定地傳至后代.試驗結果證明該試驗構建的兩種轉(zhuǎn)SV40T不同區(qū)段的策略是成功的,其建立的陽性轉(zhuǎn)基因小鼠