用于檢測(cè)雌二醇的酶熱傳感技術(shù)研究.pdf

1、食品安全問(wèn)題目前在我國(guó)已經(jīng)成為一項(xiàng)非常嚴(yán)峻的社會(huì)民生問(wèn)題，而其中獸藥的非法添加及濫用是引起動(dòng)物性食品危害的主要原因之一。雌二醇是一種小分子甾體類激素，喂食或在皮下埋植可起到促進(jìn)動(dòng)物食欲、增加體重、提高蛋白轉(zhuǎn)化率、改善瘦肉比、增加產(chǎn)率等作用，因此在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中曾被廣泛應(yīng)用。而美國(guó)環(huán)境保護(hù)局早在1996年就將其劃定為環(huán)境內(nèi)分泌干擾物之一，多國(guó)均對(duì)其制訂了相關(guān)限量標(biāo)準(zhǔn)，我國(guó)農(nóng)業(yè)部更明確規(guī)定雌二醇不得在動(dòng)物性食品中檢出。環(huán)境內(nèi)分泌干擾物可通過(guò)食

2、物鏈的富集作用對(duì)人體以及整個(gè)自然生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生一系列的危害，其中牛奶及乳制品中雌二醇等雌激素殘留的問(wèn)題已經(jīng)嚴(yán)重威脅到了我國(guó)青少年兒童的身體健康，因此對(duì)其在食物中的殘留進(jìn)行嚴(yán)格有效的監(jiān)控是十分必要的。目前用于雌二醇檢測(cè)的多為色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，這些方法需要大型昂貴的儀器及專業(yè)人員的操作，樣品前處理復(fù)雜耗時(shí)，難以滿足食品安全現(xiàn)場(chǎng)快速的檢測(cè)要求。為了有效的維護(hù)食品安全、控制獸藥濫用，在此我們建立了一種高效、靈敏的用于雌二醇的酶熱傳感檢測(cè)方法并初

3、步應(yīng)用于牛奶樣品的檢測(cè)。該方法基于直接競(jìng)爭(zhēng)法的免疫學(xué)檢測(cè)原理，同時(shí)充分發(fā)揮了酶熱傳感技術(shù)快速、簡(jiǎn)便、特異的優(yōu)點(diǎn)，無(wú)需繁瑣的樣品前處理工作，獲得結(jié)果穩(wěn)定可靠。
　　本研究的研究?jī)?nèi)容主要從以下幾方面展開(kāi):
　　1)雌二醇的羧基化改造、偶聯(lián)及單克隆抗體的純化
　　由于雌二醇是小分子類物質(zhì)，不便于在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用，通過(guò)加入KOH及溴乙酸，應(yīng)用乙酸乙酯萃取及甲醇-氯仿重結(jié)晶對(duì)其進(jìn)行了羧基化改造，并通過(guò)EDC方法與目標(biāo)酶蛋白偶聯(lián)。通過(guò)

4、核磁氫譜鑒定改造產(chǎn)物E2-3-CME，通過(guò)質(zhì)譜鑒定羧基化雌二醇與β-內(nèi)酰胺酶偶聯(lián)成功，偶聯(lián)比約為12∶1。同時(shí)采取辛酸-硫酸銨鹽析法對(duì)雌二醇單克隆抗體進(jìn)行了純化，通過(guò)ELISA鑒定其性質(zhì)良好并初步確定了用于下一步檢測(cè)的抗原-抗體稀釋比例。
　　2)酶熱傳感檢測(cè)體系的優(yōu)化
　　實(shí)驗(yàn)中采用TELISA技術(shù)，使用瓊脂糖凝膠顆粒SPG作為填充酶柱的固相載體吸附雌二醇抗體，待測(cè)樣品中雌二醇與β-內(nèi)酰胺酶標(biāo)記的雌二醇競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體上的位點(diǎn)

5、，通過(guò)加入β-內(nèi)酰胺酶對(duì)應(yīng)底物產(chǎn)生的熱信號(hào)推算待測(cè)小分子的濃度。對(duì)實(shí)驗(yàn)中所涉及的反應(yīng)底物、系統(tǒng)流速、載液、再生等參數(shù)進(jìn)行逐步優(yōu)化。最終確立酶熱檢測(cè)體系如下：體系溫度37℃，底物氨芐西林(4mmol/L);抗原抗體稀釋比E21∶200/E2-mAb1∶16000;載液0.02mol/LPBS+2％DMSO+0.5％甘油，pH7.0;再生條件:0.1mol/LGly-Hcl+0.5mol/LNacl+1％DMSO+0.1％TritonⅩ-1

6、00，pH2.3（變速1200uL/min×6分鐘）;系統(tǒng)流速400μL/min;樣品共同孵育30min/共同進(jìn)樣;進(jìn)樣時(shí)間:6min30sec。以上所用的稀釋液及載液均經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾、超聲除氣及37℃恒溫水浴。
　　3)構(gòu)建了用于雌二醇檢測(cè)的酶熱傳感檢測(cè)方法
　　在系統(tǒng)優(yōu)化的基礎(chǔ)上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，E2標(biāo)準(zhǔn)品用純DMSO溶解后進(jìn)行從0到200ng/ml之間9個(gè)點(diǎn)的梯度稀釋，依標(biāo)準(zhǔn)程序打開(kāi)酶熱傳感器，待基線平穩(wěn)后依次加樣

7、（每次進(jìn)樣量350μl）-再生-記錄峰信號(hào);同等條件下重復(fù)試驗(yàn)3次，取均值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)曲線為:Y=96.4438+(6.7545-96.4438)/(1+(x/10.57676)^2.5011), R2=0.9902, IC50值:10.2ng/mL,線性檢測(cè)范圍:5.1-19.4 ng/mL，最低檢測(cè)限2.8ng/mL。在E212.5ng/mL濃度測(cè)定穩(wěn)定性良好，X±S:80.8±2.8mv， CV:3.4％（n=6、峰高值

8、）。與雌激素類結(jié)構(gòu)類似物雌酮、雌三醇、左炔諾孕酮及己烯雌酚依次檢測(cè)，交叉反應(yīng)率均低于0.01％，特異性良好。優(yōu)化建立了一種簡(jiǎn)易的牛奶樣品前處理方法:將液態(tài)牛奶樣品分裝后離心30分鐘，抽取中層乳清層，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。獲取的牛奶樣品可順利應(yīng)用于酶熱傳感設(shè)備的檢測(cè)，空白樣品基質(zhì)干擾信號(hào)可以忽略。在此基礎(chǔ)上繪制了基于牛奶模擬樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=97.91128+(2.91161-97.91128)/1+(X/0.32696)^2.32955，

9、R2=0.9982，IC50值:0.45ng/mL，線性檢測(cè)范圍:0.24-0.79ng/mL，最低檢測(cè)限0.12ng/mL。測(cè)定加標(biāo)回收率均集中在100％附近，與大型儀器LC-ESI-MS進(jìn)行方法比對(duì)后具有良好的一致性。
　　目前酶熱傳感技術(shù)較少有報(bào)道應(yīng)用于農(nóng)獸藥殘留的檢測(cè)，在激素類小分子物質(zhì)的檢測(cè)方面更是空白，本研究構(gòu)建了一種適用于食品安全現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)工作的快速、高效、簡(jiǎn)便且經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法，拓展了酶熱技術(shù)的應(yīng)用，具有廣泛的應(yīng)用及發(fā)

10、展前景。在固定化酶柱方面引入了SPG作為檢測(cè)中吸附抗體的固相載體，既省略了固定化酶（或其它生物識(shí)別原件）的步驟，又實(shí)現(xiàn)了更換抗原-抗體對(duì)子即可更換檢測(cè)目標(biāo)物的目的，從而使這一傳感技術(shù)具有了良好的通用性。通過(guò)對(duì)牛奶模擬樣品的檢測(cè)，探索出了一種快速有效的牛奶樣品前處理方法，可達(dá)到較好的檢測(cè)靈敏度和穩(wěn)定性，同時(shí)也為今后應(yīng)用于其他方面食品的檢測(cè)提供了思路。實(shí)驗(yàn)中獲得的檢測(cè)低限較為理想，但檢測(cè)范圍偏窄，可能與雌二醇在牛奶樣品中代謝分布的復(fù)雜性有關(guān)