基于多組學(xué)數(shù)據(jù)的代謝綜合征及代謝組分相關(guān)遺傳變異的探索和解析.pdf

1、代謝綜合征是一組代謝指標(biāo)異常癥侯群，主要表現(xiàn)為中心性肥胖、高血壓和糖脂代謝紊亂。研究表明，代謝綜合征會(huì)增加心腦血管疾病、糖尿病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。按中國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)定義，2010年我國(guó)居民代謝綜合征患病率達(dá)17.6％。雙生子研究表明，遺傳因素在代謝異常的發(fā)生中起了重要的作用。
　　經(jīng)典的全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study, GWAS)已發(fā)現(xiàn)了一些與代謝異常相關(guān)的遺傳變異，但仍存在以下兩大問(wèn)題:(1)

2、已發(fā)現(xiàn)的位點(diǎn)僅能解釋少量的遺傳度，即存在大量丟失的遺傳度(missing heritability)有待進(jìn)一步探究;(2)以往研究主要關(guān)注表型相關(guān)的標(biāo)簽SNP(tag SNP)及與之距離最近的基因，但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，大部分的定位信號(hào)并不通過(guò)與之距離最近的基因起作用，如現(xiàn)已證明，定位在FTO上的肥胖相關(guān)位點(diǎn)主要通過(guò)遠(yuǎn)程調(diào)控IRX3基因表達(dá)影響表型。總之，以往對(duì)GWAS定位信號(hào)的解析非常有限，多數(shù)關(guān)鍵基因和效應(yīng)位點(diǎn)(causalvariant

3、)未被找到，不利于后續(xù)功能研究。
　　近些年研究發(fā)現(xiàn)，大部分表型相關(guān)遺傳變異通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)水平進(jìn)而影響表型。若以基因表達(dá)調(diào)控作為注釋?zhuān)梢詫⑷蚪M的篩選范圍縮小到基因表達(dá)數(shù)量性狀基因座(expression Quantitative Trait Loci，eQTLs)上，提高發(fā)現(xiàn)表型相關(guān)位點(diǎn)的效率。ENCODE、GTEx、Roadmap等研究項(xiàng)目陸續(xù)公布了大量可用于注釋遺傳變異對(duì)表型調(diào)控路徑中多個(gè)組學(xué)的信息，包括具有組織特異性

4、的基因表達(dá)、DNA甲基化、組蛋白修飾、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。這些信息可用于進(jìn)一步精確篩選表型相關(guān)遺傳變異，也可用于對(duì)已知信號(hào)的重新解析。
　　以往的研究主要以歐裔人群為主，在我國(guó)漢族人群中的研究還很有限，由于不同人種間存在遺傳背景的差異，歐裔人群的研究結(jié)果不能直接外推至中國(guó)漢族人群。為了系統(tǒng)地探索代謝綜合征及代謝組分相關(guān)的遺傳易感位點(diǎn)，本研究以我國(guó)漢族人群為主要研究對(duì)象，通過(guò)基于多組學(xué)注釋的全基因組關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)并解析代謝異常相關(guān)的遺傳

5、變異。研究?jī)?nèi)容分為三個(gè)部分（圖1）:
　　第一部分采用經(jīng)典的全基因組關(guān)聯(lián)分析策略，篩選與代謝綜合征及代謝組分關(guān)聯(lián)信號(hào)最強(qiáng)的遺傳變異位點(diǎn)并進(jìn)行多階段驗(yàn)證、功能分析和基因環(huán)境交互效應(yīng)分析。
　　第二部分在第一部分研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄調(diào)控的注釋?zhuān)M(jìn)一步篩選與糖脂代謝相關(guān)的遺傳變異，通過(guò)精細(xì)定位和功能實(shí)驗(yàn)，解析基本調(diào)控路徑。
　　第三部分針對(duì)已知的糖脂代謝關(guān)聯(lián)信號(hào)，利用最新的多組學(xué)注釋信息對(duì)信號(hào)區(qū)域進(jìn)行系統(tǒng)化的重解析，探究

6、關(guān)鍵的調(diào)控基因，為關(guān)聯(lián)分析的成果轉(zhuǎn)化提供支持。
　　圖1研究?jī)?nèi)容示意圖左上側(cè)圖為課題組開(kāi)展的代謝綜合征GWAS關(guān)聯(lián)信號(hào)（P值）的曼哈頓圖，圖下左側(cè)為第一部分技術(shù)路線，右側(cè)為第二部分技術(shù)路線。右側(cè)圖為NHGRI-EBI GWAS catalog記錄的表型相關(guān)的位點(diǎn)，為研究的第三部分，采用多組學(xué)注釋?zhuān)瑢?duì)與代謝異常相關(guān)的位點(diǎn)進(jìn)行系統(tǒng)化重解析。
　　第一部分代謝綜合征的遺傳易感性研究
　　一、研究目的:
　　在中國(guó)漢族人

7、群中篩選并驗(yàn)證代謝綜合征相關(guān)的遺傳易感性位點(diǎn)。
　　二、材料和方法:
　　以單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)為遺傳變異標(biāo)記，首先在杭州蕭山地區(qū)1742例樣本中采用全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法，篩選出與代謝綜合征及代謝組分關(guān)聯(lián)信號(hào)最強(qiáng)的位點(diǎn)，然后對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行多階段獨(dú)立樣本驗(yàn)證，驗(yàn)證樣本來(lái)自我國(guó)東部、北部、東北部等多個(gè)地區(qū)，共計(jì)10978例。合并多階段驗(yàn)證結(jié)果后，對(duì)達(dá)到全基因組陽(yáng)性水平的位點(diǎn)進(jìn)行功能預(yù)測(cè)、基因環(huán)境交互效應(yīng)分析。
　　三、研究

8、結(jié)果:
　　通過(guò)代謝綜合征的全基因組關(guān)聯(lián)分析及多階段獨(dú)立樣本的驗(yàn)證，研究發(fā)現(xiàn)位于APOA5上的rs651821位點(diǎn)和位于ALDH2上亞洲人特有的高頻錯(cuò)義突變位點(diǎn)rs671的基因型與代謝綜合征的遺傳易感性相關(guān)。在控制了APOA基因簇區(qū)域內(nèi)最強(qiáng)信號(hào)rs651821后，位于BUD13上的rs180326位點(diǎn)仍然與血清甘油三酯(triglyceride，TG)水平相關(guān)(Pcombined=2.4E-08)，是APOA基因簇內(nèi)一個(gè)新的第二信

9、號(hào)(secondary signal)。在整合了遺傳變異位點(diǎn)rs651821、rs180326、血清APOA5、BUD13的蛋白水平、TG水平后分析發(fā)現(xiàn)，除了APOA5外，BUD13也參與了血清TG水平的調(diào)控。此外，研究發(fā)現(xiàn)rs671位點(diǎn)的多態(tài)性不僅會(huì)通過(guò)影響乙醛代謝影響人們的飲酒行為，該位點(diǎn)還與飲酒行為之間存在對(duì)代謝綜合征及相關(guān)代謝表型的交互效應(yīng)，其效應(yīng)主要存在于飲酒人群中。
　　四、小結(jié):
　　(1)在中國(guó)漢族人群中，r

10、s651821(APOA5)和rs671(ALDH2)位點(diǎn)的基因型與代謝綜合征的遺傳易感性相關(guān);
　　(2) rs180326(BUD13)基因型與血清TG水平相關(guān)，其效應(yīng)獨(dú)立于已知位點(diǎn)rs651821(APOA5);
　　(3) rs671(ALDH2)的基因型與飲酒行為存在交互效應(yīng)。
　　第二部分基于注釋信息的糖脂代謝相關(guān)遺傳變異篩選及精細(xì)定位
　　一、研究目的:
　　在第一部分研究的基礎(chǔ)上，結(jié)合多組學(xué)

11、注釋信息，進(jìn)一步篩選和驗(yàn)證糖脂代謝指標(biāo)相關(guān)的遺傳變異位點(diǎn);對(duì)新發(fā)現(xiàn)的糖脂代謝相關(guān)遺傳變異位點(diǎn)進(jìn)行精細(xì)定位，并通過(guò)功能實(shí)驗(yàn)確認(rèn)效應(yīng)位點(diǎn)。
　　二、材料和方法:
　　首先，通過(guò)對(duì)1742例樣本（同第一部分）的糖脂代謝的全基因組關(guān)聯(lián)分析，得到與表型相關(guān)的但又未被第一部分驗(yàn)證過(guò)的遺傳變異位點(diǎn);然后分析這些位點(diǎn)與脂肪、肝臟、胰島和骨骼肌中基因表達(dá)水平的關(guān)聯(lián)，并將這些位點(diǎn)的信號(hào)與表型關(guān)聯(lián)信號(hào)共定位，找出與糖脂代謝表型相關(guān)的eQTLs;進(jìn)

12、一步通過(guò)多階段獨(dú)立樣本驗(yàn)證基因型與表型的關(guān)聯(lián);對(duì)驗(yàn)證達(dá)到全基因組陽(yáng)性水平的位點(diǎn)，通過(guò)以基因?yàn)閱挝坏姆治霾呗?gene-based analyses)推測(cè)其可能的調(diào)控基因;并通過(guò)ENCODE和Roadmap計(jì)劃提供的相關(guān)組織細(xì)胞中染色質(zhì)狀態(tài)、組蛋白修飾、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合信號(hào)推測(cè)調(diào)控活性區(qū)域及其對(duì)應(yīng)的效應(yīng)位點(diǎn);最后構(gòu)建包含不同等位基因的載體，通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)確認(rèn)其表達(dá)調(diào)控作用。
　　三、研究結(jié)果:
　　通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析及

13、eQTL的注釋?zhuān)l(fā)現(xiàn)了22個(gè)與糖脂代謝相關(guān)的遺傳變異位點(diǎn)在特定的組織中影響基因表達(dá)，多階段獨(dú)立樣本驗(yàn)證確認(rèn)了rs1880118位點(diǎn)與血清HDL-C水平的關(guān)聯(lián)(Pcombined=1.4E-10)。該位點(diǎn)可以tag的區(qū)域主要包括DAGLB和RAC1兩個(gè)基因，在加性模型下，rs1880118的基因型可以解釋DAGLB(diacylglycerol lipase，beta)基因在皮下脂肪組織中表達(dá)水平變異的47.7％(P=5.9E-42)。同

14、時(shí)，通過(guò)TWAS、SMR、Sherlock等以基因?yàn)閱挝坏难芯糠椒?，我們發(fā)現(xiàn)DAGLB基因與血清HDL-C水平之間存在關(guān)聯(lián)，關(guān)聯(lián)的P值分別為3.0E-08、1.1E-04和1.6E-06。進(jìn)一步通過(guò)組蛋白信號(hào)H3K27ac、H3K4me3，H3K9ac及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合區(qū)域、DNA酶Ⅰ超敏位點(diǎn)的定位，找到了位于DAGLB基因5'區(qū)域的調(diào)控活性片段，熒光素酶報(bào)告基因的結(jié)果顯示，該活性片段中rs4724806位點(diǎn)（與rs1880118位點(diǎn)LD

15、r2=0.77）可能是真正的效應(yīng)位點(diǎn)，其最小等位基因會(huì)增加轉(zhuǎn)錄活性，與eQTL分析的結(jié)果一致。
　　四、小結(jié):
　　rs1880118是一個(gè)在中國(guó)漢族人群中新發(fā)現(xiàn)的與血清HDL-C水平相關(guān)的遺傳變異位點(diǎn)，其效應(yīng)位點(diǎn)rs4724806通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性影響DAGLB基因表達(dá)，該部分研究提示了DAGLB基因在脂代謝中的作用。
　　第三部分利用多組學(xué)注釋系統(tǒng)解析糖脂代謝相關(guān)的遺傳變異
　　一、研究目的:
　　結(jié)合多

16、組學(xué)注釋信息，對(duì)已知的糖脂代謝相關(guān)遺傳變異信號(hào)區(qū)域進(jìn)行系統(tǒng)的解析，探究基因型到表型的調(diào)控路徑，為后續(xù)功能研究提供支持。
　　二、研究方法:
　　首先，整理已報(bào)道的與糖脂代謝相關(guān)的遺傳變異位點(diǎn);然后，利用千人基因組計(jì)劃提供的位點(diǎn)間連鎖不平衡信息，填補(bǔ)出所有與lead SNP高度連鎖不平衡的位點(diǎn)用于后續(xù)的精細(xì)定位和功能預(yù)測(cè);接著，對(duì)這些位點(diǎn)進(jìn)行系統(tǒng)的多組學(xué)注釋?zhuān)ɑ虮磉_(dá)、染色質(zhì)狀態(tài)、DNA甲基化、組蛋白修飾、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合等。

17、對(duì)位于編碼區(qū)域的遺傳變異位點(diǎn)，再進(jìn)行物種間保守性估計(jì)、翻譯后修飾等翻譯水平的注釋;最后，整理推測(cè)出可能的基因型到表型調(diào)控路徑。
　　三、研究結(jié)果:
　　對(duì)經(jīng)篩選過(guò)濾后得到的592個(gè)糖脂代謝相關(guān)遺傳變異位點(diǎn)進(jìn)行填補(bǔ)后，共計(jì)17646個(gè)位點(diǎn)納入后續(xù)精細(xì)定位分析(LD r2＞0.5)。在轉(zhuǎn)錄水平，通過(guò)遺傳變異與基因表達(dá)相關(guān)的注釋?zhuān)l(fā)現(xiàn)了104個(gè)在內(nèi)臟脂肪、肝臟、骨骼肌或胰島細(xì)胞中與基因表達(dá)水平相關(guān)的位點(diǎn)。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一些與特定環(huán)境

18、刺激相關(guān)的eQTLs，如rs702485位點(diǎn)與DAGLB基因表達(dá)的關(guān)聯(lián)僅出現(xiàn)在LPS刺激后(Pbefore＞0.05，Pafter=2.52E-16)。133個(gè)糖脂代謝相關(guān)位點(diǎn)與脂肪組織或胰島細(xì)胞中的DNA甲基化相關(guān)，其中許多位點(diǎn)與多個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化水平相關(guān)。經(jīng)過(guò)對(duì)遺傳變異位點(diǎn)的精細(xì)定位，我們發(fā)現(xiàn)有49個(gè)位點(diǎn)可以關(guān)聯(lián)(tag)到一個(gè)或以上的位于組蛋白修飾信號(hào)峰區(qū)域內(nèi)的位點(diǎn)，且具有組織特異性。在翻譯水平，有122個(gè)（r2＞0.5）或4

19、3個(gè)(r2＞0.8)位點(diǎn)可以關(guān)聯(lián)到一個(gè)或以上的非同義突變位點(diǎn)，其中有16個(gè)位點(diǎn)經(jīng)SIFT和Polyphen注釋均提示存在影響蛋白功能的可能。對(duì)糖代謝相關(guān)位點(diǎn)rs1535500精細(xì)定位和功能預(yù)測(cè)后發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)G到T的變異與附近7個(gè)CpG位點(diǎn)的存在相關(guān)聯(lián)，這些位點(diǎn)靠近KCNK17基因5'端的CpG島，存在影響DNA甲基化的可能。通過(guò)對(duì)胰島細(xì)胞中多個(gè)組學(xué)的信息整合，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)確實(shí)可以通過(guò)影響附近位點(diǎn)甲基化水平進(jìn)而影響KCNK17的表達(dá)，這不同

20、于以往報(bào)道認(rèn)為該信號(hào)主要通過(guò)KCNK16起作用。
　　四、小結(jié):
　　(1)通過(guò)整合多個(gè)組學(xué)信息，對(duì)糖脂代謝GWAS信號(hào)進(jìn)行重新解析后發(fā)現(xiàn)了許多可能參與到遺傳變異影響表型調(diào)控路徑中的基因及調(diào)控元件。與其他復(fù)雜表型類(lèi)似，經(jīng)過(guò)注釋后，三分之一的基因與以往對(duì)該位點(diǎn)報(bào)道一致。
　　(2)僅有7％-20％的糖脂代謝表型相關(guān)遺傳變異位點(diǎn)可以關(guān)聯(lián)到一個(gè)或以上的非同義或無(wú)義突變，其余可能通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平影響表型。
　　(3)通過(guò)對(duì)糖

21、代謝相關(guān)的位點(diǎn)rs1535500的精細(xì)定位，發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)G到T的變異與附近位點(diǎn)CpG位點(diǎn)的存在相關(guān)聯(lián)，進(jìn)而影響甲基化水平調(diào)控KCNK17的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　基于以上三部分內(nèi)容，得出以下結(jié)論:
　　(1)在中國(guó)漢族人群中，rs651821(APOA5)和rs671(ALDH2)位點(diǎn)的基因型與代謝綜合征的遺傳易感性相關(guān);新發(fā)現(xiàn)的rs180326(BUD13)位點(diǎn)與血清TG水平的關(guān)聯(lián)獨(dú)立于區(qū)域內(nèi)已知位點(diǎn)rs651821;

22、rs671與飲酒行為存在交互效應(yīng)。
　　(2)結(jié)合轉(zhuǎn)錄調(diào)控注釋信息可優(yōu)化GWAS的篩選策略;rs1880118是一個(gè)在中國(guó)漢族人群中新發(fā)現(xiàn)的與血清HDL-C水平相關(guān)的遺傳變異位點(diǎn)，與該位點(diǎn)高度連鎖不平衡的rs4724806位點(diǎn)多態(tài)性會(huì)通過(guò)調(diào)控DAGLB基因表達(dá)影響表型。
　　(3)80％以上的糖脂代謝相關(guān)位點(diǎn)主要通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄水平影響表型;經(jīng)多組學(xué)注釋推測(cè)的調(diào)控基因中有三分之一與原GWAS報(bào)道的基因一致，如文獻(xiàn)報(bào)道糖代謝相關(guān)位