ABCB11基因突變與原發(fā)性肝內(nèi)膽管結石發(fā)病機制的相關性研究.pdf

1、目的：
　　ABCB11基因編碼的蛋白質(bile salt export pump，BSEP)的功能主要是膽汁轉運，而其基因突變與膽汁淤積及膽石癥發(fā)病密切相關。前期研究中也表明ABCB11基因在原發(fā)性肝內(nèi)膽管結石患者中存在基因突變，并且影響到編碼蛋白的表達。因此，本研究目的重點是深入探討ABCB11基因突變與原發(fā)性肝內(nèi)膽管結石發(fā)病的聯(lián)系，以及研究ABCB11基因突變影響其編碼蛋白BSEP在細胞定位、表達的機制。
　　方法：

2、
　　1.收集收治的原發(fā)性肝內(nèi)膽管結石患者443例（入院以后均經(jīng)術前影像學檢查明確診斷），同時收集我院健康體檢中心健康人群560例為對照組（均排除慢性肝病及膽石癥）。收集上述PIS患者和健康人群的外周血液5ml，立即分離淋巴細胞，放-80℃冰箱保存。收集統(tǒng)計原發(fā)性肝內(nèi)膽管結石患者相關臨床資料。
　　2.提取淋巴細胞DNA，并通過對ABCB11基因全外顯子測序，檢測病例組（原發(fā)性肝內(nèi)膽管結石患者）與對照組（健康人群）ABCB1

3、1基因突變，在此基礎上進一步分析ABCB11基因突變與臨床資料間的關聯(lián)。
　　3.對原發(fā)性肝內(nèi)膽管結石患者的新鮮冰凍肝組織提取總mRNA與膜蛋白，并采用定量PCR技術與western blot技術檢測原發(fā)性肝內(nèi)膽管結石患者ABCB11基因的mRNA與BSEP的表達，在此基礎上進一步分析與ABCB11基因突變的相關性。
　　4.構建包含人的ABCB11基因全部開放閱讀框的野生型質粒，通過定點突變再構建突變型質粒。HEK293細

4、胞分別轉染野生型和突變型質粒，轉染48小時后提取總mRNA與膜蛋白，并運用定量PCR技術與western blot技術檢測突變型與野生型質粒的mRNA與BSEP的表達。轉染MDCK細胞分別轉染野生型和突變型質粒，轉染48小時后進行免疫染色，采用激光共聚焦顯微鏡掃描技術觀察BSEP在MDCK細胞的分布。
　　結果：
　　1.原發(fā)性肝內(nèi)膽管結石患者與健康人群相比ABCB11基因存在兩個有意義的突變位點，分別是錯義突變rs1181

5、09635(p=0.025)與同義突變rs497692(p=0.006)，并且這兩個突變位點與術前黃疸具有密切相關性(p=0.026，p=0.011)。
　　2.發(fā)生錯義突變rs118109635的原發(fā)性肝內(nèi)膽管結石患者肝組織BSEP表達降低，mRNA表達水平無變化，而發(fā)生同義突變rs497692的原發(fā)性肝內(nèi)膽管結石患者肝組織mRNA與BSEP表達都降低。
　　3.在細胞水平我們也發(fā)現(xiàn)突變rs118109635(A865V)

6、使BSEP在HEK293細胞膜上表達降低，在MDCK細胞膜上分布減少，而mRNA表達水平無變化。
　　結論：
　　ABCB11基因突變（rs118109635和rs497692）與原發(fā)性肝內(nèi)膽管結石存在密切聯(lián)系，并且與術前黃疸具有密切相關性。同時，具有rs118109635或rs497692突變的原發(fā)性肝內(nèi)膽管結石患者肝組織BSEP的表達均明顯降低。此外，體外實驗也表明突變rs118109635使BSEP在細胞膜上表達以及分