線粒體tRNAs基因突變在原發(fā)性高血壓發(fā)病機制中的作用.pdf

1、第一部分原發(fā)性高血壓患者tRNAs基因突變篩查及資料收集
　　 研究目的:
　　 1．建立一個含有DNA樣品、永生細胞系、臨床資料和家系資料的原發(fā)性高血壓遺傳資源庫。
　　 2．展開原發(fā)性高血壓人群線粒體的7個tRNA基因（tRNAVal、tRNAIle、tRNAMet、tRNAAla、tRNASer(UCN)、tRNAAsp和tRNALys基因)突變的篩查，發(fā)現(xiàn)新的突變位點，深入研究線粒體tRNA基因突變與原發(fā)

2、性高血壓的關系。
　　 3．分析不同線粒體遺傳背景對原發(fā)性高血壓的發(fā)生、發(fā)展和臨床表型的影響，繪制原發(fā)性高血壓tRNA基因突變頻譜。
　　 研究方法:
　　 1．提取收集血液樣本的基因組DNA。
　　 2．用聚合酶鏈反應(PCR)對7個tRNA基因進行擴增，然后純化、測序。
　　 3．使用生物軟件(DNAstar、Codoncodealigner、Chromas)分析測序結果，找出所有的多態(tài)性位點

3、和突變位點。
　　 4．對tRNA基因上的突變位點進行tRNA二級結構分析、保守性分析，分析其對原發(fā)性高血壓表型表達的影響。
　　 5．計算各突變位點的突變頻率，并繪制突變頻譜。
　　 6．對于有意義的tRNA基因突變位點，進一步研究其在原發(fā)性高血壓發(fā)病機制中的作用。
　　 研究結果:
　　 1．原發(fā)性高血壓患者中有28個突變位點存在于7個tRNA易感基因（tRNAVal、tRNAIle、tRNA

4、Met、tRNAAla、tRNASer(UCN)、tRNAAsp和tRNALys基因）。
　　 2．正常對照人群中有10個突變位點存在于5個tRNA易感基因(tRNAVal、tRNAAla、tRNASer(UCN)、tRNAAsp和tRNALys基因）。
　　 3．發(fā)現(xiàn)一例tRNAMet基因A4435G突變，對其進行家系調(diào)查、完善臨床資料，進一步研究其在原發(fā)性高血壓發(fā)病機制中的作用。
　　 4．發(fā)現(xiàn)兩例tRNAA

5、la基因T5587C突變，經(jīng)tRNA二級結構、保守性分析，結合臨床資料分析，呈典型的母系遺傳。
　　 結論:
　　 1．原發(fā)性高血壓患者tRNA基因突變明顯比正常對照人群多，說明tRNA基因突變在原發(fā)性高血壓發(fā)生發(fā)展中有一定作用，并為研究tRNA基因突變對原發(fā)性高血壓的影響提供遺傳資料基礎。
　　 2．A4435G突變位于tRNAMet基因的第37位，反密碼子的3’鄰近端，突變可能改變tRNAMet的二級結構和功

6、能，造成線粒體呼吸鏈的功能缺陷，影響原發(fā)性高血壓的發(fā)生發(fā)展。
　　 3．T5587C突變位于tRNAAla基因的3’端末尾部位，可能影響3’端的剪切、加尾等過程，影響tRNA的穩(wěn)定性和功能，可能是原發(fā)性高血壓的發(fā)病機制之一。
　　 第二部分線粒體tRNAMetA4435G突變可能是與原發(fā)性高血壓相關的突變位點
　　 研究目的
　　 1．了解一例攜帶tRNAMet基因A4435G突變的原發(fā)性高血壓家系的臨床

7、表型、外顯率和表現(xiàn)度，分析該突變對原發(fā)性高血壓表型表達的影響。
　　 2．分析線粒體遺傳背景、核修飾基因、環(huán)境因素（吸煙、飲酒和心理因素等）對原發(fā)性高血壓家系外顯率和表現(xiàn)度的影響。
　　 3．對一例攜帶tRNAMet基因A4435G突變的原發(fā)性高血壓家系的臨床、遺傳和分子生物學特征進行分析，為原發(fā)性高血壓相關基因的調(diào)查、診斷及預防提供分子流行病學數(shù)據(jù)。
　　 研究方法
　　 1．家系調(diào)查的研究對象包括先證

8、者、母系成員、部分父系成員或其配偶，收集臨床資料，包括生活習慣、病史采集和相關的實驗室檢查。
　　 2．先證者進行線粒體全基因組擴增、測序；該家系其他成員進行基因段的擴增，驗證是否存在A4435G突變。
　　 3．使用生物軟件(DNAStar、Chromas、Codoncodealigner、ClustalX)分析先證者全序，找出所有的多態(tài)性位點和突變位點，進行單體型、保守性及tRNA二級結構分析。
　　 研究結

9、果
　　 1．先證者及母系成員都存在tRNAMet基因A4435G突變，但作為對照的家系中母系成員的配偶不存在tRNAMet基因A4435G突變。
　　 2．先證者全序共42個突變位點，其中有3個tRNA基因存在突變：tRNAMetA4435G、tRNAAlaC5601T、tRNALeu(CUN)A12280G，保守指數(shù)分別為100％，50％,75％。
　　 3．線粒體單體型分析：G2a1。A4435G突變位于t

10、RNAMet基因第A37位，反密碼子的3’鄰近端，此位點十分保守，且易被修飾，修飾后的該位點在反密碼子識別的高保真度和維持tRNA三級結構及生化功能的穩(wěn)定性上起著非常重要的作用。
　　 結論
　　 1．該家系呈典型的母系遺傳，說明線粒體基因上tRNAMet基因A4435G突變在原發(fā)性高血壓的發(fā)生發(fā)展中有一定的作用。
　　 2．A4435G突變將使A37位識別障礙，影響tRNAMet基因穩(wěn)定性，造成tRNA基因功能

11、缺陷，減低線粒體蛋白合成速率，最終損傷線粒體呼吸鏈功能，可能在原發(fā)性高血壓的發(fā)生發(fā)展中起作用。
　　 3．先證者單體型G2a1，可能影響原發(fā)性高血壓家系的表型表達。
　　 4．母系成員攜帶有tRNAMetA4435G發(fā)病年齡和病情程度存在差別，表明核修飾基因、環(huán)境因素、生活習慣等對原發(fā)性高血壓的形成有一定影響。
　　 第三部分線粒體tRNAAlaT5587C突變與原發(fā)性高血壓的相關性研究
　　 研究發(fā)現(xiàn)兩

12、例tRNAAla基因T5587C突變，T5587C突變位于tRNAAla基因的3’端末尾部位，此位置對線粒體tRNA的識別十分重要。此突變可能影響3’端的剪切、加尾、氨?；冗^程，影響它的保真度和線粒體翻譯效率，進而將對整個tRNA功能產(chǎn)生影響。16物種的保守指數(shù)為93.8％。單體型均為F1。經(jīng)分析T5587C突變對tRNAAla基因二級結構的影響、保守性分析和臨床資料及家系調(diào)查顯示呈典型的母系遺傳。
　　 此外，線粒體tRNA