線粒體VDAC在母系遺傳原發(fā)性高血壓分子遺傳機制及功能中的研究.pdf

1、原發(fā)性高血壓(essential hypertension，EHT)是當今社會最常見的心血管疾病，與冠心病、腦卒中、心力衰竭和腎功能障礙密切相關，是導致多種心血管疾病死亡的主要危險因素之一，其患病率在我國有逐年增高的趨勢。線粒體病由于突變的線粒體逐漸積累，導致線粒體氧化磷酸化功能受損，細胞功能下降。線粒體tRNA突變是線粒體疾病的研究熱點之一。線粒體含有22種tRNA。既往的研究也發(fā)現(xiàn)原發(fā)性高血壓具有家族聚集傾向性，其中一些具有明顯母系

2、遺傳特點，而且線粒體疾病往往同時表現(xiàn)血壓升高，提示我們線粒體DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)突變可能與血壓升高有一定的相關性。 我們對2000名原發(fā)性高血壓患者進行了測序分析，其中發(fā)現(xiàn)一個具有典型母系遺傳特點的大家系，我們收集了5代104人，其中母系成員27人。我們對家系成員的一般情況、血壓等進行測量和統(tǒng)計，對其中42人進行全身體格檢查、采血進行生化和心臟超聲檢查。結果發(fā)現(xiàn)該家系中母系成員高血壓患病率高達

3、55.6％，非母系成員高血壓患病率15.6％(P＜0.01)；母系成員高血壓發(fā)病年齡有提前的趨勢(Ⅱ代62.0±6.2歲；Ⅲ代46.3±5.8歲；Ⅳ代23.3±2.9歲)；母系成員血壓與年齡、吸煙、飲酒和高鹽飲食有明顯相關性(P＜0.05)；母系成員血糖、總膽固醇、血鈉明顯高于非母系成員(P＜0.05)。分子生物學研究發(fā)現(xiàn)在線粒體tRNAn?；虻?263位點發(fā)生了A一÷G點突變，該位點在各個生物都是高度保守的，而且4263位于tRNA

4、Ile基因的受體臂5’端，在這個位點發(fā)生突變會影響tRNA與氨基酸的結合。 為了進一步探討線粒體tRNAIle4263 A→G點突變影響血壓的具體機制，我們對該家系的4個母系成員(3個血壓異常和1個血壓正常者)和3名遺傳背景相同的對照者建立了傳代淋巴細胞系，對這些細胞的生長速度及線粒體外膜的VDAC(voltage-dependent anion channel)在攜帶tRNAIle4263 A→G點突變高血壓患者發(fā)病中的作用進

5、行了初步研究。結果發(fā)現(xiàn)攜帶A4263G突變者淋巴細胞倍增時間明顯延長；VDAC及凋亡相關因子Bax在高血壓患者表達增高，而淋巴細胞sKCa通道表達沒有明顯差異；流式細胞儀檢測線粒體膜電勢，結果發(fā)現(xiàn)與正常對照者比較攜帶tRNAIle4263 A→G點突變高血壓者線粒體膜電勢降低，而加入CsA-VDAC拮抗劑后線粒體膜電勢升高，與正常者之間的差異消失；共聚焦顯微鏡檢測線粒體外膜的VDAC與Bax蛋白結合的情況，結果發(fā)現(xiàn)攜帶tRNAIle42

6、63 A→G點突變高血壓患者線粒體外膜VDAC綠色熒光與Bax蛋白紅色熒光融合，而正常對照者兩者沒有融合，在加入CsA后高血壓患者線粒體外膜VDAC綠色熒光與Bax蛋白紅色熒光沒有融合。 為明確VDAC在攜帶mtDNA突變的高血壓患者細胞線粒體鈣循環(huán)中的作用，我們在對具有母系遺傳特點的原發(fā)性高血壓流行病學調查研究的基礎上，對前期發(fā)現(xiàn)的攜帶mtDNA4263A→G突變的原發(fā)性高血壓大家系患者采集血液樣本，通過建立傳代的淋巴細胞系，

7、分別加入VDAC抑制劑-CsA和PT(通透性轉變孔道)開放劑-蒼術苷，利用共聚焦顯微鏡技術研究VDAC在攜帶mtDNA突變的高血壓患者細胞線粒體鈣循環(huán)中的作用，結果發(fā)現(xiàn)與正常對照者淋巴細胞線粒體內鈣熒光強度及△ψm(線粒體膜電勢)降低，在加入蒼術苷后正常者線粒體內鈣熒光強度增加，而突變攜帶者沒有明顯改變，但兩者△ψm均降低，而加入CsA后可以抑制蒼術苷作用。 通過此課題研究治療直接證明了線粒體tRNAIle4263 A→G點突變

8、與高血壓發(fā)病直接有關，我們的實驗也首次從生物進化及分子生物學證據(jù)證明：線粒體DNAtRNAIle4263 A→G點突變在具有母系遺傳特點的高血壓發(fā)病中起著重要作用；通過對攜帶線粒體tRNAIle4263 A→G點突變高血壓患者和正常者淋巴細胞建立細胞系，研究發(fā)現(xiàn)線粒體外膜的VDAC表達及功能改變可以影響線粒體膜電勢(△ψm)、誘導凋亡物質釋放及對線粒體內鈣([Ca2+]m)，因此推測VDAC在線粒體tRNAIle4263 A→G點突變導