版權(quán)說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權(quán),請(qǐng)進(jìn)行舉報(bào)或認(rèn)領(lǐng)
文檔簡介
1、自身免疫性甲狀腺病(autoimmune thyroid disease,AITD)是一類多發(fā)病,包括Graves病(Graves’disease,GD)、橋本甲狀腺炎(Hashimoto’s thyroiditis,HT)等。GD是甲狀腺毒癥最常見類型,促甲狀腺激素受體(TSH receptor,TSHR)是GD的主要抗原,在病理?xiàng)l件下可刺激機(jī)體產(chǎn)生TSHR抗體(thyrotropinreceptor antibody,TRAb),T
2、RAb包括甲狀腺刺激性抗體(thyroid stimulatingantibody,TSAb)、甲狀腺刺激阻斷性抗體(thyroid stimulating blocking antibody,TSBAb)和中性抗體等自身抗體。其中TSAb可刺激甲狀腺激素分泌增多致甲亢。TSAb是GD的主要病因,對(duì)GD的發(fā)生發(fā)展起重要作用。TSHR分膜外區(qū)(TSHR-ecd)、跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū),TRAb結(jié)合位點(diǎn)主要分布在TSHR-ecd,研究表明TSAb
3、的抗原表位主要分布于TSHR-ecd的氨基端(TSHRn)。本室在研究TSHR抗原決定簇分布的基礎(chǔ)上,將TSHR-ecd分段表達(dá),進(jìn)行了抗原決定簇分布的篩選,在TSHR-ecd氨基端篩選出主要與TSAb結(jié)合的抗原決定簇相對(duì)集中的基因片段(TSHRn462bp),并進(jìn)行原核表達(dá),獲得了能與TSAb結(jié)合的該基因片段編碼的融合蛋白,即硫氧還蛋白-人促甲狀腺激素受體膜外區(qū)氨基端片段蛋白(TrxFus-hTSHRn),為建立TRAb(以TSAb為
4、主)檢測技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。
熒光酶免疫分析技術(shù)(fluorescent-enzyme immunoassay,F(xiàn)EIA)是在酶聯(lián)免疫分析技術(shù)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)基礎(chǔ)上,通過測定酶催化熒光底物發(fā)出的熒光強(qiáng)度而建立的一種定量檢測超微量物質(zhì)的熒光酶免疫分析技術(shù),其比ELISA更靈敏、測量范圍更寬。
本研究以重組TrxFus-hTSHRn為抗原,建立定量檢測
5、人血清TRAb(以TSAb為主)FEIA,并應(yīng)用于臨床,為AITD的診療提供依據(jù)。
目的:
應(yīng)用基因工程技術(shù)原核表達(dá)hTSHR膜外區(qū)氨基端片段基因,獲取TrxFus-hTSHRn融合蛋白,以此為抗原建立定量人血清TRAb(以TSAb為主)FEIA,并應(yīng)用于臨床,探討其對(duì)AITD特別是GD的診斷、鑒別診斷、療效監(jiān)測和預(yù)后的臨床價(jià)值。
方法:
1.人TSHR膜外區(qū)氨基端融合蛋白(Trx
6、Fus-hTSHRn)原核表達(dá)、純化及鑒定。
將本室構(gòu)建的hTSHRn-ecd重組表達(dá)質(zhì)粒pET102/D-hTSHRn462bp轉(zhuǎn)入表達(dá)工程菌E.Coli BL21 StarTM(DE3),誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白,經(jīng)變性Ni2+-NTA(鎳-氮川乙酸)親和層析純化,梯度透析復(fù)性、濃縮,獲得重組TrxFus-hTSHRn,經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定其分子量,蛋白免疫印跡(Western blot
7、ting)鑒定免疫活性。
2.以TrxFus-hTSHRn為抗原建立定量人血清TRAb(以TSAb為主)FEIA及方法學(xué)鑒定。
將重組融合蛋白TrxFus-hTSHRn包被聚苯乙烯96孔板,以待測樣品血清中TRAb為第一抗體,以本室制備的TRAb校準(zhǔn)品(WHO推薦的TRAb參考制劑(WHO NIBSC90/672)的“二次校準(zhǔn)物”)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線,堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人IgG為第二抗體,4-甲基磷酸傘形酮(4-
8、MUP)為熒光底物建立定量人血清TRAb(以TSAb為主)FEIA。最佳實(shí)驗(yàn)條件的探索:(1)抗原包被量(2)待測樣品血清稀釋度(3)熒光底物稀釋度(4)熒光底物反應(yīng)時(shí)間(5)反應(yīng)終止液作用時(shí)間等因素組合后做交叉試驗(yàn),確定最佳實(shí)驗(yàn)條件。鑒定該法靈敏度、特異性、精密度、準(zhǔn)確度、健全性、相關(guān)性等指標(biāo)。檢測167例正常人血清樣品(均為男性,年齡19-28歲(22.6±2.7)),確立陽性切點(diǎn)值(cut-off point value)。
9、> 3.定量人血清TRAb(以TSAb為主)FEIA的臨床應(yīng)用。
檢測6種甲狀腺疾病患者559例,分為8組①Graves'病(GD)甲亢初發(fā)組:183例(男81例,女102例,年齡18-70歲(40.6±11.2));②GD治療3-9個(gè)月組:56例(男20例,女36例,年齡28-68歲(39.6±11.0));③GD治療1年組:64例(男33例,女31例,年齡32-65歲(42.1±13.9)),④橋本甲狀腺炎(HT
10、)初發(fā)伴甲減組:112例(男39例,女73例,年齡24-79歲(44.5±13.1));⑤單純性甲狀腺腫大組:22例(男8例,女14例,年齡19-67歲(42.0±13.1));⑥結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組:49例(男28例,女21例,年齡22-60歲(31.0±12.5));⑦臨床診斷甲狀腺腺瘤組:21例(男10例,女11例,年齡17-68歲(38.7±12.4));⑧亞急性甲狀腺炎組:52例(男24例,女28例,年齡21-66歲(45.0±9
11、.0))。
4.統(tǒng)計(jì)方法。
人血清TRAb(以TSAb為主)測定濃度(mIU/L)以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”(x±s)表示。組間比較采用方差分析(ANOVA),各組陽性率比較采用卡方檢驗(yàn)(x2檢驗(yàn))。變量間相關(guān)分析采用直線相關(guān)分析和一致性檢驗(yàn)(kappa分析)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)果:
1.人TSHR膜外區(qū)氨基端融合蛋白(TrxFus-hTSHRn)原核表達(dá)、純化及鑒定。<
12、br> 含重組表達(dá)質(zhì)粒pET102/D-hTSHRn462bp的表達(dá)工程菌E.Coli BL21 StarTM(DE3)在2×YT培養(yǎng)基中37℃過夜搖菌(200rpm)培養(yǎng),以異丙基β-D-硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thoiglactoside,IPTG)為誘導(dǎo)劑,終濃度1mM,37℃誘導(dǎo)4小時(shí),產(chǎn)物在變性條件下Ni2+-NTA親和層析純化,梯度透析復(fù)性、濃縮,獲得重組融合蛋白TrxFus-hTSHRn,經(jīng)SDS-P
13、AGE測定TrxFus-hTSHRn分子量約為37.5KD,純度約91.2%,考馬斯亮藍(lán)(CBG)法定量,不同批次生產(chǎn)的融合蛋白產(chǎn)率約為21.5-28.4mg/L培養(yǎng)基,Western Blotting鑒定TrxFus-hTSHRn免疫活性良好。
2.以TrxFus-hTSHRn為抗原建立定量人血清TRAb(以TSAb為主)FEIA及方法學(xué)鑒定。
2.1、最佳實(shí)驗(yàn)條件。
TrxFus-hTSHR
14、n抗原包被量100ng/孔,4℃過夜;待測樣品血清稀釋度1:100,37℃溫育60分鐘;堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗人IgG二抗稀釋度1:20000,37℃溫育60分鐘;熒光底物4-MUP稀釋度1:10,37℃避光溫育60分鐘;加反應(yīng)終止液50mM乙二胺四乙酸(EDTA),37℃避光溫育5分鐘后在熒光儀上測定相對(duì)熒光單位(PFU)計(jì)數(shù)。
2.2、標(biāo)準(zhǔn)曲線。
以WHO推薦的TRAb參考制劑(WHO NIBSC90/672
15、)的“一次校準(zhǔn)物”(Medizym()T.R.A.Calibrators)為標(biāo)準(zhǔn)(對(duì)照品),對(duì)本室制備的TRAb校準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)定,并結(jié)合臨床建立本法的標(biāo)準(zhǔn)曲線,各點(diǎn)濃度分別為(S1-S5)0.07mIU/L,0.22 mIU/L,0.72 mIU/L,4.26 mIU/L,9.68 mIU/L。
2.3、結(jié)果計(jì)算。
待測樣品血清1:100稀釋后測得的RFU值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的濃度值×100(樣品稀釋倍數(shù))即為待
16、測樣品血清的TRAb(以TSAb為主)濃度(mIU/L)。
2.4、方法學(xué)鑒定。
①靈敏度:本法檢測靈敏度0.05mIU/L。
②特異性:TrxFus-hTSHRn與hTRAb特異性結(jié)合,與人甲狀腺過氧化物酶抗體(hTPOAb)無交叉結(jié)合反應(yīng)。
③精密度:陽性血清、陰性血清批內(nèi)變異(CV%)(n=6)分別為4.47%和9.25%。批間變異(CV%)(n=8)分別為7.29%和13.
17、57%。
④準(zhǔn)確度:測定高、中、低濃度樣品回收率分別為102.13%、97.50%、98.00%,平均回收率97.46%。
⑤健全性:將GD甲亢患者血清進(jìn)行兩次對(duì)倍稀釋后做平行實(shí)驗(yàn),血清樣品稀釋曲線(r=0.9983)與標(biāo)準(zhǔn)曲線(r=0.9979)成平行關(guān)系,本法健全性良好。
⑥相關(guān)性:本法與意大利索林(DiaSorin)公司放射受體法(RRA)TRAb檢測試劑盒同檢51例GD患者(不同療程)血
18、清樣品,兩法檢測結(jié)果顯著相關(guān)(r=0.767,P<0.05;一致性檢驗(yàn)kappa=0.791,P<0.01)。
2.5、確定陽性切點(diǎn)值。
檢測167例健康男性血清TRAb(以TSAb為主)濃度為(x±s)23.5±9.7mIU/L,以x+2s(單側(cè)95%可信區(qū)間)為陽性切點(diǎn)值,即42.9 mIU/L。
3.定量人血清TRAb(以TSAb為主)FEIA的臨床應(yīng)用。
3.1、6種甲狀腺
19、疾病患者血清TRAb(以TSAb為主)含量(mIU/L)分析。
①GD初發(fā)組(142.5±23.2)顯著高于其它各組(P均<0.01)。
②GD治療1年組(75.6±35.0)與GD治療3-9個(gè)月組(93.1±30.3)無顯著差別(P>0.05),這兩組均顯著低于GD初發(fā)組(142.5±23.2)(P均<0.01),但均仍顯著高于正常人(23.5±9.7)(P均<0.05)。
③GD治療3-9個(gè)
20、月組(93.1±30.3)、GD治療1年組(75.6±35.0)、HT初發(fā)伴甲減組(71.3±14.7)均顯著高于單純性甲狀腺腫組(25.6±12.0)、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組(38.7±13.5)、甲狀腺腺瘤組(41.0±8.8)、亞急性甲狀腺炎組(40.3±10.6)(P均<0.05)。
④單純性甲狀腺腫組、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組、甲狀腺腺瘤組、亞急性甲狀腺炎組與正常人無顯著差別(P均>0.05)。
3.2、6種甲狀
21、腺疾病患者血清TRAb(以TSAb為主)陽性率分析。
①GD初發(fā)甲亢組陽性率(88.94%)高于其它各組(P均<0.01)。
②GD治療1年組陽性率(38.62%)低于GD治療3-9個(gè)月組(64.09%)(P<0.05),這兩組陽性率均顯著低于GD初發(fā)甲亢組(88.94%)(P均<0.05),但仍均顯著高于正常人(4.91%)(P均<0.01)。
③GD治療3-9個(gè)月組(64.09%)、GD治療
22、1年組(38.62%)、HT初發(fā)伴甲減組(61.88%)均顯著高于單純性甲狀腺腫組(0.85%)、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組(3.71%)、甲狀腺腺瘤組(5.01%)、亞急性甲狀腺炎組(11.69%)(P均<0.05)
④單純甲腫、甲狀腺腺瘤、結(jié)甲腫、亞甲炎組與正常人無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)
結(jié)論:
1.重組表達(dá)質(zhì)粒pET102/D-hTSHRn462bp在E.Coli BL21 StarTM(DE
23、3)中高效表達(dá),獲得了能與TSAb結(jié)合的hTSHRn-ecd重組融合蛋白TrxFus-hTSHRn,該蛋白純度約91.2%,產(chǎn)率21.5-28.4mg/L培養(yǎng)基,免疫活性好。
2.制備并標(biāo)定了TRAb校準(zhǔn)品,建立了以重組融合蛋白TrxFus-hTSHRn為抗原、以96孔板為固相載體的定量檢測人血清TRAb(以TSAb為主)FEIA。本法靈敏、特異、穩(wěn)定、簡便。
3.本法用于甲狀腺疾病患者臨床觀察,GD甲亢患者
溫馨提示
- 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請(qǐng)下載最新的WinRAR軟件解壓。
- 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請(qǐng)聯(lián)系上傳者。文件的所有權(quán)益歸上傳用戶所有。
- 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會(huì)有圖紙預(yù)覽,若沒有圖紙預(yù)覽就沒有圖紙。
- 4. 未經(jīng)權(quán)益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
- 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲(chǔ)空間,僅對(duì)用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護(hù)處理,對(duì)用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對(duì)任何下載內(nèi)容負(fù)責(zé)。
- 6. 下載文件中如有侵權(quán)或不適當(dāng)內(nèi)容,請(qǐng)與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
- 7. 本站不保證下載資源的準(zhǔn)確性、安全性和完整性, 同時(shí)也不承擔(dān)用戶因使用這些下載資源對(duì)自己和他人造成任何形式的傷害或損失。
最新文檔
- 定性及定量促甲狀腺激素快速測定免疫膠體金法臨床應(yīng)用評(píng)估.pdf
- 促甲狀腺激素受體抗體及程序性死亡因子5在Graves病中的應(yīng)用研究.pdf
- 促甲狀腺激素受體在甲狀腺癌中的表達(dá)及其臨床意義.pdf
- 甲狀腺自身抗體及促甲狀腺激素與分化型甲狀腺癌的關(guān)系.pdf
- Graves病促甲狀腺激素受體抗體與中醫(yī)證型關(guān)系的初步研究.pdf
- 促甲狀腺激素受體在甲狀腺乳頭狀癌亞型中的表達(dá)及臨床意義.pdf
- Graves病患者ATD治療前后血清促甲狀腺激素受體抗體水平變化及分析.pdf
- 促甲狀腺激素
- 大鼠促甲狀腺激素tsh酶聯(lián)免疫分析
- 甲狀腺激素受體
- 新型熒光定量PCR檢測HBV方法的建立及初步臨床應(yīng)用.pdf
- 細(xì)菌革蘭雙檢熒光定量PCR技術(shù)的建立及臨床應(yīng)用.pdf
- 犬瘟熱病毒熒光抗體的建立及初步應(yīng)用.pdf
- PRRSV熒光原位雜交檢測法的建立及臨床應(yīng)用.pdf
- 定量檢測人超敏C-反應(yīng)蛋白雙抗體夾心ELISA方法的建立及初步臨床應(yīng)用.pdf
- 布魯氏菌熒光定量PCR檢測方法的建立及應(yīng)用.pdf
- 熒光定量RT-PCR檢測人TGF-β1 mRNA方法學(xué)建立及初步臨床應(yīng)用.pdf
- 人高靈敏度促甲狀腺激素(u-tsh)酶聯(lián)免疫分析
- 牙鲆甲狀腺激素受體TRαA的原核表達(dá)和多克隆抗體的制備及其應(yīng)用.pdf
- 江西地區(qū)成年人促甲狀腺激素正常參考值范圍建立及影響因素分析.pdf
評(píng)論
0/150
提交評(píng)論