稀土氧化釹致大鼠肺損傷作用機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的：
　　為探究稀土氧化釹的肺損傷作用及機(jī)制，為接觸人群的安全暴露和作業(yè)場(chǎng)所職業(yè)接觸限值的制定提供科學(xué)依據(jù)，我們進(jìn)行了本實(shí)驗(yàn)研究。
　　研究方法：
　　1.將SD大鼠按體重隨機(jī)分為氧化釹染塵組（100mg/kg）和對(duì)照組，采用非暴露式氣管內(nèi)灌注法一次性進(jìn)行染毒。分別在染毒后的第3d、7d、14d、21d、28d五個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠。
　　2.收集大鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)，分析BALF中細(xì)胞成分，測(cè)定B

2、ALF中總蛋白含量，采用酶聯(lián)免疫法（ELISA法）測(cè)定BALF中MCP-1、MIP-1α、ICAM-1、IL-1β、TNF-α、IL-6的含量。
　　3.收集大鼠肺組織標(biāo)本，取部分標(biāo)本采用HE染色法，染色后通過(guò)普通光鏡下觀(guān)察肺組織病理學(xué)改變;同時(shí)取部分標(biāo)本進(jìn)行天狼猩紅染色，染色后用Nikon Eclipse E800偏振光顯微鏡及Image-Pro Plus Version4.5forwindowsTM圖象分析系統(tǒng)分析大鼠肺組織中

3、膠原纖維變化情況。
　　4.提取大鼠肺組織蛋白，采用Western blotting法及非放射性凝膠遷移實(shí)驗(yàn)EMSA(EMSA)法測(cè)定大鼠肺組織中NF-κB p65、p-NFκB p65、p-IKK beta及NF-κB的表達(dá)。
　　5.培養(yǎng)NR8383細(xì)胞，采用MTT法測(cè)定稀土氧化釹對(duì)細(xì)胞的毒性作用;采用透射電鏡法及流式細(xì)胞法觀(guān)察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化及凋亡情況;采用酶聯(lián)免疫法（ELISA法）測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液上清中MCP-1、MI

4、P-1α、TGF-β1、IL-1β、TNF-α、IL-8的含量。
　　6.提取染毒后細(xì)胞蛋白，Western blotting法測(cè)定細(xì)胞中p-NFκB p65、p-IκKβ和Caspase-3的表達(dá)
　　研究結(jié)果：
　　1.實(shí)驗(yàn)大鼠體重及肺臟器系數(shù)變化
　　大鼠染毒后第3、7、14、21和28d體重均低于對(duì)照組大鼠體重，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而大鼠肺臟器系數(shù)均高于對(duì)照組(P＜0.05)，提示可能是氧化

5、釹粉塵致大鼠肺組織發(fā)生炎癥反應(yīng)致充血、水腫或組織增生。
　　2.染塵大鼠肺組織Ⅰ型、Ⅲ型膠原面積百分比變化情況
　　與對(duì)照組比較，染塵組大鼠各觀(guān)察點(diǎn)肺組織Ⅰ型膠原面積百分比均有不同程度的增加，第7天、第14天、第21天和第28天時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。隨著染塵時(shí)間的延長(zhǎng)，Ⅰ型膠原面積百分比逐漸增加。第28d時(shí)，Ⅰ型膠原面積百分比增加了1倍。
　　3.染塵大鼠BALF中細(xì)胞因子水平的測(cè)定
　　與對(duì)照組

6、相比，氧化釹染塵組大鼠BALF中IL-1和TNF-α的表達(dá)水平顯著增加(P＜0.05)，染塵組大鼠BALF中IL-6表達(dá)水平增加，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　與對(duì)照組相比，氧化釹染塵組大鼠BALF中炎癥趨化因子(MCP-1，MIP-1α和ICAM-1)的表達(dá)水平呈增高趨勢(shì)。MCP-1和MIP-1α僅在第28天時(shí)表達(dá)水平顯著增加(P＜0.05)。
　　4.染塵組大鼠NF-κB相關(guān)蛋白表達(dá)情況
　　氧化釹染塵組

7、，大鼠肺組織內(nèi)p-NF-κB P65蛋白表達(dá)量的增加，而大鼠肺組織內(nèi)NF-κB P65總蛋白水平并沒(méi)有發(fā)生變化;在染塵第14天，大鼠肺組織內(nèi)p-IKKβ及p-NF-κ B P65的表達(dá)水平達(dá)到高峰，到第28天呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。對(duì)照組中大鼠肺組織內(nèi)p-NF-κB P65，NF-κB P65和p-IKKβ的表達(dá)未觀(guān)察到變化。氧化釹染塵組，大鼠肺組織N F-κB P50/P65的核轉(zhuǎn)位被誘導(dǎo)，與蛋白印跡法測(cè)定的結(jié)果相一致。更重要的是，大鼠肺組織內(nèi)

8、NF-κB P50/P65的遷移在第3天增加，第14天達(dá)高峰，在第21天開(kāi)始下降。
　　5.稀土氧化釹顆粒物對(duì)NR8383細(xì)胞的毒性作用
　　NR8383細(xì)胞經(jīng)稀土氧化釹顆粒物混懸液處理12h、24h、48h后，1.56、3.125、6.25μg/mL染毒組在各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞抑制率與對(duì)照組相比，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05);隨著稀土氧化釹顆粒物濃度的增加，細(xì)胞抑制率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)（R2值分別為0.959、0.948、0.9

9、43）;在染毒濃度為50、100、200μg/mL時(shí)，不同染毒時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞抑制率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.54，P＜0.05; F=17.596，P＜0.05; F=9.332，P＜0.05);稀土氧化釹顆粒物作用于NR8383細(xì)胞，細(xì)胞毒性呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。
　　6.不同濃度稀土氧化釹顆粒物暴露對(duì)NR8383細(xì)胞凋亡的影響
　　NR8383細(xì)胞經(jīng)不同濃度稀土氧化釹顆粒物混懸液處理24h后，各染毒組早期凋

10、亡細(xì)胞百分比呈現(xiàn)不同程度的增加，6.25、12.5μg/mL染毒組早期凋亡細(xì)胞百分比與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，12.5μg/mL染毒組早期凋亡細(xì)胞百分比是對(duì)照組的7.2倍。在0μg/ml～25μg/mL濃度范圍內(nèi)，隨著染毒濃度的增加，晚期凋亡細(xì)胞百分比(1.8％、2.4％、2.6％、3.8％、4.1％)逐漸增加，12.5、25、50μg/mL染毒組晚期凋亡細(xì)胞百分比與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)

11、。至50μg/mL時(shí)，凋亡細(xì)胞百分比開(kāi)始下降。
　　7.不同濃度稀土氧化釹顆粒物刺激對(duì)NR8383細(xì)胞上清中IL-1β、 TNF-α、 IL-8、MCP-1、MIP-1α、 TGF-β1分泌的影響
　　稀土氧化釹顆粒物刺激NR8383細(xì)胞24h后，染毒組NR8383細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α、IL-8、MCP-1、MIP-1α及TGF-β1的含量均高于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，且染毒組細(xì)胞分泌IL-1

12、β、TNF-α、IL-8、MCP-1、MIP-1α及TGF-β1的含量隨著染毒劑量的增加呈現(xiàn)增高趨勢(shì)(R2值分別為0.986、0.923、0.922、0.990、0.985、0.984)，不同染毒組之間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。
　　8.細(xì)胞毒性與細(xì)胞因子之間的相關(guān)性分析
　　稀土氧化釹顆粒物刺激NR8383細(xì)胞24h后，細(xì)胞抑制率與上清中TNF-α、IL-1β、IL-8、MCP-1、MIP-1α及TGF-β

13、1的含量均呈正相關(guān)(P＜0.01);且TGF-β1、 MIP-1α、MCP-1、TNF-α、IL-1β及IL-8的含量與細(xì)胞抑制率之間的相關(guān)系數(shù)分別0.912、0.932、0.933、0.935、0.943、0.962。
　　9.NR8383細(xì)胞中Caspase-3、p-NF-κB p65和p-IκKβ的表達(dá)
　　NR8383細(xì)胞給予稀土氧化釹顆粒物刺激24h后，各染毒組細(xì)胞表達(dá)p-NFκBp65、p-IκKβ的量均高于對(duì)照

14、組，且濃度為12.5、25、50ug/mL時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;各染毒組細(xì)胞Caspase-3的表達(dá)量均高于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　10.細(xì)胞因子與NF-κB相關(guān)蛋白之間的相關(guān)性分析
　　稀土氧化釹顆粒物刺激NR8383細(xì)胞24h后，NF-κB相關(guān)蛋白(p-NF-κBP65、p-IKKβ)與上清中TNF-α、IL-1β、IL-8、MCP-1、 MIP-1α及TGF-β1的含量均呈正

15、相關(guān);IL-1β、IL-8、TNF-α、MCP-1、 MIP-1α及TGF-β1的含量與p-NF-κBP65之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.484、0.359、0.539、0.527、0.535、0.598;;IL-1β、IL-8、TNF-α、MCP-1、 MIP-1α及TGF-β1的含量與p-IKKβ之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.326、0.299、0.406、0.397、0.407、0.391。
　　11.細(xì)胞因子與Caspase-3之間的

16、相關(guān)性分析
　　稀土氧化釹顆粒物刺激NR8383細(xì)胞24h后， Caspase-3與上清中TNF-α、IL-1β、IL-8、MCP-1、 MIP-1α及TGF-β1的含量均呈正相關(guān)，IL-1β、IL-8、TNF-α、MCP-1、MIP-1α及TGF-β1的含量與Caspase-3之間的相關(guān)系數(shù)分別為0.177、0.121、0.300、0.258、0.300、0.277。
　　結(jié)論：
　　(1)稀土Nd2O3顆粒物通過(guò)非

17、氣管暴露的方式進(jìn)入大鼠肺組織，可致大鼠發(fā)生急性肺組織損傷，早期表現(xiàn)以炎性損傷為主，晚期可形成纖維細(xì)胞性結(jié)節(jié)。
　　(2)在稀土氧化釹顆粒物致大鼠急性肺損傷過(guò)程中，促炎和抗炎細(xì)胞因子以及蛋白表達(dá)顯著增加，NF-κB由細(xì)胞漿向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移并活化，NF-κB炎性通路被激活，說(shuō)明NF-κB在稀土氧化釹顆粒物導(dǎo)致肺損傷過(guò)程中具有重要作用。
　　(3)培養(yǎng)液上清中的炎性細(xì)胞因子及趨化因子的含量顯著升高，肺泡巨噬細(xì)胞的p-NF-κBP65、

18、p-IKKβ蛋白表達(dá)顯著升高，NF-κB信號(hào)通路激活。
　　(4)肺泡巨噬細(xì)胞的凋亡程度隨著炎性細(xì)胞因子和趨化因子及Caspase-3表達(dá)水平的升高而升高，炎性細(xì)胞因子與Caspase-3呈正相關(guān)，TNF-α/TNFR/NF-κ B信號(hào)通路對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞的凋亡可能具有促進(jìn)作用。
　　(5)細(xì)胞分泌的炎性細(xì)胞因子水平、p-NF-κBP65、p-IKKβ蛋白的表達(dá)水平、肺泡巨噬細(xì)胞的凋亡水平以及其相互作用關(guān)系，說(shuō)明NF-κB信號(hào)