Anti-HER3抗體抑制Herceptin耐藥及功能優(yōu)化研究.pdf

1、隨著腫瘤發(fā)病分子機(jī)制的深入研究，針對關(guān)鍵基因、特異性細(xì)胞受體和調(diào)控分子的靶向性治療已成為腫瘤臨床治療的重要途徑?？贵w藥物以其特異性、靶向性、安全性以及臨床有效性等優(yōu)勢在腫瘤靶向性治療中發(fā)揮重要作用，目前比較熱門的腫瘤治療的靶標(biāo)包括HER家族等一系列分子。
　　HER2是 HER家族成員之一，在乳腺癌、卵巢癌等多種癌癥中過表達(dá)。Herceptin、Perjeta、T-DM1等多個抗體、抗體-小分子偶聯(lián)藥物成功上市，并逐步成為HER2

2、陽性腫瘤的臨床治療一線用藥。雖然HER2抗體在HER2陽性腫瘤的臨床治療中取得良好效果，但是HER2陽性乳腺癌的反應(yīng)率僅為20~30％，及Herceptin治療后期出現(xiàn)抗體耐藥的現(xiàn)象限制了抗體靶向性治療范圍和效率。因此，明確抗體的耐藥機(jī)制以及確定評估抗體療效的生物標(biāo)志物，對于優(yōu)化治療方案、提高療效具有重要的意義。
　　HER3是表皮生長因子受體HER家族成員，是PI3K/AKT信號通路中關(guān)鍵的激活因子。研究顯示，多種腫瘤在使用EG

3、FR和HER2抑制劑治療時，HER3的表達(dá)上調(diào)，磷酸化水平提高。因此，HER3在抗腫瘤中的作用逐步得到重視。各種靶向HER3的抑制劑中，單克隆抗體主要通過阻斷HER3與配體HRG結(jié)合或者阻斷HER3與其他HER家族成員形成異二聚體等分子機(jī)制，阻斷HER3下游信號通路激活，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長。目前靶向 HER3的單克隆抗體藥物Duligotuzumab、Patritumab均已進(jìn)入臨床 II期研究， Seribantuma、DL11、S

4、eribantumab、LJM716、RG7116等多個抗體處于臨床前研究中。
　　治療性抗體具有特異性高、半衰期長、副作用小等諸多優(yōu)勢，但因?yàn)槠浞肿恿看髲亩拗屏似鋯为?dú)用藥療效。近年來，抗體藥物偶聯(lián)（antibody-drug conjugate， ADC）技術(shù)發(fā)展迅速。ADC藥物結(jié)合了抗體藥物和細(xì)胞毒性藥物兩者的優(yōu)點(diǎn)，具有抗體藥物的特異性和細(xì)胞毒藥物的強(qiáng)細(xì)胞毒性，在治療腫瘤上取得了更好效果，是新一代靶向治療藥物的主要研究方向。

5、MylotargTM、AdcetrisTM、KadcylaTM等ADC藥物成功上市，使得人們更為關(guān)注ADC藥物。
　　本研究內(nèi)容基于前期獲得的對曲妥珠（Herceptin）具有耐藥性的卵巢癌細(xì)胞系（SKOV3/T），觀察比較了具有耐藥性的SKOV3/T細(xì)胞的增殖、信號通路和成瘤性的差異，并對SKOV3/T耐藥性中出現(xiàn)的HER3表達(dá)異常進(jìn)行了深入探討；針對HER3靶點(diǎn)設(shè)計、優(yōu)化、篩選、表達(dá)了靶向HER3的全人單克隆抗體，并對HER3

6、全人單克隆抗體和價靶向HER3的ADC藥物進(jìn)行了體、內(nèi)外功能活性評價。
　　本研究集中于以下三個方面：
　　(一)曲妥珠耐藥細(xì)胞株SKOV3/T中HER3異常表達(dá)
　　合理評價曲妥珠耐藥卵巢癌細(xì)胞系SKOV3/T的細(xì)胞增殖及成瘤能力。體外細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)以及體內(nèi)荷瘤動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，SKOV3/T細(xì)胞增殖及成瘤能力顯著高于正常卵巢癌細(xì)胞SKOV3。進(jìn)一步通過流式細(xì)胞術(shù)和Western blot方法對SKOV3/T細(xì)胞和S

7、KOV3細(xì)胞表面HER1、HER2以及HER3表達(dá)水平進(jìn)行鑒定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與SKOV3細(xì)胞株相比，SKOV3/T細(xì)胞株中HER1基因的表達(dá)未發(fā)生明顯改變，HER2基因表達(dá)顯著下調(diào)，而HER3基因表達(dá)上調(diào)。
　　(二)靶向HER3抗體抑制曲妥珠耐藥腫瘤細(xì)胞
　　為了驗(yàn)證 HER3在曲妥珠耐藥中的作用，我們合成表達(dá)了特異性抗 HER3抗體LmAb3，并對其生物學(xué)活性進(jìn)行檢定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LmAb3可以特異性識別重組表達(dá)的H

8、ER3抗原和天然的HER3分子，親和力Kon值為2.46E-10，并能特異性抑制HER家族分子磷酸化水平，并抑制HER3陽性的MCF7腫瘤細(xì)胞增殖。
　　進(jìn)一步利用特異性抗HER3抗體LmAb3為工具，探討HER3在曲妥珠耐藥中的作用。三維培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，特異性 anti-HER3抗體阻斷后，SKOV3/T細(xì)胞增殖被顯著抑制。建立小鼠SKOV3/T耐藥細(xì)胞皮下荷瘤模型，使用特異性anti-HER3抗體治療后，腫瘤生長受到抑制，而

9、生理鹽水對照組和Heceptin治療組則對SKOV3/T腫瘤未見明顯抑制作用。
　　為了探討 HER3抗體抑制曲妥珠耐藥細(xì)胞中的分子機(jī)制，我們進(jìn)一步分析HER3激活的下游信號通路中HER1、HER2、HER3以及AKT等關(guān)鍵分子磷酸化水平，特異性anti-HER3抗體阻斷后，HER1、HER2、HER3以及 AKT等分子磷酸化程度均受抑制。
　　(三)靶向HER3抗體的優(yōu)化及生物學(xué)功能評價
　　利用分子模擬技術(shù)對靶向H

10、ER3抗體進(jìn)行合理優(yōu)化設(shè)計，結(jié)合生物學(xué)功能分析，獲得了一株高親和力、特異性識別HER3的新抗體FD001。
　　進(jìn)一步利用抗體偶聯(lián)技術(shù)將抗HER3抗體FD001與毒物小分子DM1進(jìn)行偶聯(lián)，獲得靶向HER3的ADC藥物FD001-DM1。體內(nèi)外生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示， FD001-DM1具有良好的抑制腫瘤增殖能力。
　　本研究的創(chuàng)新之處：初步揭示了曲妥珠耐藥細(xì)胞株SKOV3/T中HER3異常表達(dá)，特異性 Anti-HER3抗體可一