StNHX1與OsPT2基因遺傳轉(zhuǎn)化菜用大豆培育耐鹽及磷高效利用新種質(zhì).pdf

1、隨著菜用大豆[Glycine max(L.) Merr.]市場(chǎng)需求的增加，其栽培面積正逐年擴(kuò)大。但土壤鹽漬化的日益加劇及土壤缺磷，使菜用大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)受到了嚴(yán)重影響。如何提高菜用大豆的耐鹽性及磷利用效率，以有效開(kāi)發(fā)和利用我國(guó)鹽漬及低磷土壤資源已經(jīng)成為學(xué)者十分關(guān)注的話題。本研究采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別將野生茄子(Solanumtorvum Swartz) Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（StNHX1）及水稻（Oryza sativaL.）磷轉(zhuǎn)

2、運(yùn)蛋白基因(OsPT2)遺傳轉(zhuǎn)化菜用大豆，獲得具有除草劑抗性的轉(zhuǎn)基因植株，并采用營(yíng)養(yǎng)液栽培法對(duì)轉(zhuǎn)StNHX1基因菜用大豆T3代植株進(jìn)行耐鹽性分析及轉(zhuǎn)OsPT2基因菜用大豆T2代植株進(jìn)行磷高效利用鑒定。主要研究結(jié)果如下:
　　1.從野生茄子耐鹽砧木品種‘Torvum Vigo’葉片中克隆出液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因StNHX1 ORF序列（GenBank登錄號(hào):JN606860.1）。序列分析表明，StNHX1基因ORF長(zhǎng)1

3、，599 bp，編碼532個(gè)氨基酸，StNHX1基因序列與番茄NHX1基因序列相似性為93％。進(jìn)化樹(shù)分析顯示，野生茄子StNHX1與番茄LeNHX1的親緣關(guān)系最近，與海篷子S eNHX1親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。
　　2.利用植物表達(dá)載體pCMBIA3301上的BamHⅠ與SacⅠ及SacⅠ與XbaⅠ酶切位點(diǎn)，分別將StNHX1、OsPT2基因定向插入植物表達(dá)載體pCMBIA3301中。成功構(gòu)建以gus為報(bào)告基因、bar為選擇標(biāo)記基因的植物雙

4、元表達(dá)載體pCMBIA3301-StNHX1及pCMBIA3301-OsPT2。分別將表達(dá)載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105中，用于菜用大豆的遺傳轉(zhuǎn)化。
　　3.野生茄子‘Torvum Vigor’液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因StNHX1，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)菜用大豆子葉節(jié)法遺傳轉(zhuǎn)化‘新遼鮮’，獲得轉(zhuǎn)基因植株。 PCR及Southern雜交分析顯示外源基因已整合至菜用大豆基因組中。Basta(R)涂抹葉片分析表明轉(zhuǎn)基因植株具有除草劑抗性。

5、GUS組織化學(xué)染色及半定量RT-PCR分析表明，外源基因可穩(wěn)定遺傳且StNHX1基因在T3代植株中超表達(dá)。超表達(dá)T3代植株用于耐鹽性鑒定。鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株葉片的鹽害指數(shù)、Na+及丙二醛(MDA)含量顯著低于野生型對(duì)照(WT)植株，而K+/Na+值、K+含量以及其它生理生化指標(biāo)均顯著高于WT植株。綜上結(jié)果表明，超表達(dá)StNHX1的轉(zhuǎn)基因菜用大豆具有較強(qiáng)的耐鹽性。
　　4.采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將水稻磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（OsPT2）遺傳轉(zhuǎn)化

6、菜用大豆‘新遼鮮’子葉節(jié)，共獲得10株轉(zhuǎn)基因植株。Basta(R)涂抹葉片分析表明轉(zhuǎn)基因植株具有除草劑抗性。半定量RT-PCR檢測(cè)表明OsPT2基因在T2代植株中超表達(dá)。采用改良的Hoagland營(yíng)養(yǎng)液栽培方法，對(duì)3個(gè)超表達(dá)OsPT2的T2代株系進(jìn)行磷高效利用鑒定，結(jié)果顯示:在低磷（20μMPi）及正常磷(1000μM Pi)條件下，轉(zhuǎn)基因植株的有效磷及總磷含量均顯著高于野生型對(duì)照(WT)植株。在低磷脅迫下，轉(zhuǎn)基因植株未出現(xiàn)缺磷癥狀，且