CPS1 報告體系的建立及其在肝細胞功能調控中的應用.pdf

1、背景：
　　軍事預防醫(yī)學的任務是，以部隊群體為主要的研究與保障對象，運用宏觀與微觀相結合的方法，研究武器裝備、軍事環(huán)境、軍事作業(yè)和其它有關因素，比如，作業(yè)環(huán)境、作業(yè)方式、生活方式、生物遺傳等，對軍隊人員健康的影響和所致傷害及其防護、預防與控制傷病的發(fā)生與流行，促進成員身心健康、提高戰(zhàn)斗力。肝臟是人體最大的解毒器官，對來自體內(nèi)和體外的許多非營養(yǎng)性物質如各種藥物、毒物以及體內(nèi)某些代謝產(chǎn)物，具有生物轉化作用，通過新陳代謝將它們徹底分解或

2、以原形排出體外。但肝臟很容易受特殊條件下生活方式、心理因素以及生物化學戰(zhàn)劑如布魯氏桿菌、肉毒桿菌毒素等的影響，患上如甲型或乙型肝炎、中毒性肝炎、或是肝硬化等疾病，在人口密度較高的軍隊集中爆發(fā)，危害肝臟健康，產(chǎn)生致命的傷害，影響作戰(zhàn)能力。我國是肝病大國，患病人口多，基數(shù)大，且病程長，病死率高，將會在很大程度上影響我國國民身體素質，對我國國防力量建設產(chǎn)生影響。肝衰竭仍然是一個急劇性的、不可預知的疾病，具有從60％到90%不等的高死亡率。許多

3、研究表明，肝衰竭是由于大量的肝細胞壞死導致廣泛的有毒物質在血液積累使得肝臟功能急性衰退。肝性腦病，是一種嚴重的神經(jīng)精神并發(fā)癥的急性和慢性肝衰竭，與氨濃度劇烈升高有密切關系?，F(xiàn)在肝衰竭的治療主要是基于減少氨產(chǎn)生、增加氨在腸道吸收的原則，多通過利福昔明和乳果糖起作用的。原位肝移植是肝衰竭有效的治療方法，但是現(xiàn)在能夠用于移植的肝臟數(shù)量有限，而人工肝可為患者提供部分營養(yǎng)需求并幫助患者清除體內(nèi)的有害物質，是肝臟移植的有效替代治療方法。新鮮分離出的

4、人原代肝臟細胞是用于藥物研發(fā)、臨床研究以及生物人工肝的最理想的細胞來源，但是由于肝臟供體的嚴重稀缺及很難在體外維持細胞功能等特點，使之不能擴大應用范圍；而其他細胞構成的分析模型，如動物來源的原代肝臟細胞，或人肝癌細胞系，其功能皆不能和正常人肝細胞相比擬，因為它們與人原代肝細胞往往呈指數(shù)級差異；干細胞是具有自我復制能力和多向分化潛能的細胞，且由于它的低免疫原性，臨床使用過程中并沒有明顯的副作用和不良反應，因此醫(yī)學界將其稱為“萬用細胞”，而

5、被認為是生物人工肝理想的種子細胞，基于近年來各國諸多科學家的研究，使干細胞肝向誘導分化所得的肝細胞最接近正常人原代肝細胞，但是目前遇到的瓶頸問題是，這類在體外定向分化獲得的肝細胞，可能不會表現(xiàn)出完善的功能，出現(xiàn)不能很好地表達成熟肝細胞所特異表達的轉錄因子或蛋白質的現(xiàn)象，而又或者是功能成熟的細胞數(shù)量很少，很難大規(guī)模應用。肝臟是人體的一個巨大的“化工廠”，承擔著人體內(nèi)糖、蛋白質、脂類等多種物質代謝，合成膽汁、白蛋白，進行解毒、免疫、產(chǎn)生凝血

6、因子、維持電解質平衡等諸多功能。因此，維持人工肝內(nèi)所使用肝細胞的功能對于晚期肝病患者的治療至關重要。我們以解氨毒為例，期望能夠獲得足夠的具有高效解氨毒能力的細胞，并且能夠在體外操作，通過直觀觀察即能評價其功能的體系。由于終末期肝病患者往往伴隨著高血氨癥致的肝性腦病，而氨基甲酰磷酸合成酶Ⅰ（CPS1），是尿素循環(huán)的限速酶，它存在于肝細胞的線粒體中，促進將有毒的游離氨轉換成無毒產(chǎn)物尿素，而氨基甲酰磷酸合成酶Ⅰ的這種轉化能力作為成熟肝細胞功能

7、的指標，不僅提示我們誘導CPS1表達的小分子化合物可能具有提高肝細胞的其他功能的作用，還有可能，那些能使CPS1功能降低或缺失的小分子化合物，會使細胞形態(tài)及性狀發(fā)生改變，逆轉細胞命運。由于終末分化的體細胞可以通過強制表達一些特異的轉錄因子而被重編程為多能干細胞，表明細胞的命運是可逆轉的，且不同譜系特異的轉錄因子的組合還可以直接將人和鼠的體細胞轉分化為心肌細胞，肝細胞或神經(jīng)細胞，為疾病模型的構建及再生醫(yī)學提供了可供選擇的途徑。與基因重組因

8、子相比，化學方法使用的小分子化合物具有細胞滲透性，易于合成、保護以及規(guī)范化，同時這種方法還具有可塑性。此外，研究者還可通過控制小分子化合物的濃度和持續(xù)時間來微調整個過程?；瘜W方法通過誘導調節(jié)多個信號通路，調節(jié)細胞轉錄因子和特殊基因的表達，從而促進細胞形態(tài)及功能發(fā)生轉變，繞開了其他細胞重編程方法帶來的技術問題和安全問題，給那些被傳統(tǒng)治療方法認為是“不治之癥”的疾病治療帶去希望。
　　目的：
　　目前主要的挑戰(zhàn)是如何獲得足夠可用

9、于生物人工肝進行體外解毒的細胞，尤其是針對清除體內(nèi)游離氨而提高生物人工肝在臨床使用的效果，并且能在體外操作，通過直觀觀察即能評價體外分化的肝臟細胞成熟情況的有效篩選體系；并以此為基礎，優(yōu)化已發(fā)現(xiàn)的有效藥物對肝細胞作用的條件，進一步提高藥物作用效率并減少對肝細胞的損傷。
　　方法：
　　利用CRISPR/Cas9技術構建靶向CPS1的sgRNA及打靶載體，分別用試劑轉染和電轉人肝癌細胞系HepG2、正常人肝細胞永生化細胞系LO

10、2以及人胚胎干細胞；用PCR擴增技術檢驗篩選得到細胞的DNA片段；用流式對基因編輯過的細胞進行分群；用免疫熒光進行靶蛋白定位、篩選及鑒定；通過實時定量PCR分析不同熒光強度細胞克隆的肝功能相關基因的表達情況；利用相應的試劑盒對不同熒光強度細胞克隆的白蛋白分泌量、CYP3A4酶活性、氨清除能力以及尿素生成能力進行檢測分析；利用高內(nèi)涵細胞成像技術對不同藥物及不同藥物濃度對細胞熒光強度的影響進行統(tǒng)計分析；利用CCK8試劑盒檢測不同藥物及不同藥

11、物濃度對細胞的毒性；Western Blotting分析白藜蘆醇及siCPS1處理后細胞中氨基甲酰磷酸合成酶Ⅰ蛋白水平的變化；觀察LO2細胞克隆形態(tài)以評價藥物對細胞的影響，初步探討其可能誘導重編程的機制。
　　結果：
　　基因測序顯示打靶載體構建正確；用打靶載體中的增強型紅色熒光蛋白（tdTomato）標記CPS1基因后的HepG2、LO2細胞以及人胚胎干細胞經(jīng)過G418篩選，自發(fā)表達紅色熒光蛋白；瓊脂糖凝膠電泳結果顯示PC

12、R擴增細胞DNA片段，目的條帶大小正確；通過流式分選獲得不同熒光強度的細胞，且經(jīng)過免疫熒光染色對靶蛋白定位后，獲得在線粒體中表達CPS1蛋白的細胞克隆，5個HepG2-CPS1-2atdTomato細胞克隆，4個LO2-CPS1-2atdTomato細胞克隆。實驗結果顯示不同熒光強度的HepG2細胞克隆和LO2細胞克隆，其CPS1、AAT、ALB、CYP450家族、TF基因表達水平不同，且其白蛋白分泌量，CYP3A4酶活性，氨清除能力以

13、及尿素生成能力不同，并且呈正相關性。因此，我們可在此基礎上通過直觀觀察熒光強度的增強或減弱而篩選小分子化合物，其中苯丁酸鈉和白藜蘆醇能夠顯著提高細胞熒光強度、CPS1基因表達水平、氨清除能力和尿素生成能力，除此之外，還有效地提高了AAT、ALB、TF、CYP1A2、CYP2E1、CYP3A4、C/EBPα、HNF4α、FOXO3a等功能基因和轉錄因子的表達水平；白藜蘆醇和siCPS1在分別增強和抑制了CPS1的基因、蛋白表達水平的基礎上

14、，也分別增強和抑制了細胞的紅色熒光強度；當紅色熒光蛋白標記了CPS1的胚胎干細胞肝向誘導至成熟階段，線粒體紅色熒光蛋白開始表達；減弱了LO2細胞中紅色熒光蛋白強度的小分子化合物，還能在長期無血清的細胞培養(yǎng)過程中誘導細胞形態(tài)及性狀改變，干性基因表達水平升高。
　　結論：
　　基于CRISPR/Cas技術的基因打靶，建立CPS1-2atdTomato肝細胞系HepG2和LO2、胚胎干細胞報告細胞體系，結合細胞影像能夠篩選調控細胞

15、命運的小分子化合物，與人胚胎干細胞向肝細胞定向分化體系或是誘導分化成熟的體細胞重編程恢復多功能干性的體系結合，可以成為在體外獲得穩(wěn)定代謝功能的人肝細胞的可靠篩選模型，為以后提供供體細胞、建立人源化動物模型在體研究和應用分化的干細胞進行體外藥物篩選都具有著十分重要的意義，而且用這樣的評價體系得到的肝臟細胞若具有和人成體肝臟細胞相類似的mRNA轉錄水平和蛋白表達水平，那么我們便可以用這個體系篩選出來的細胞做為藥物開發(fā)中檢測肝臟毒性、藥物相互