人類胚胎形態(tài)學(xué)分型與線粒體功能關(guān)系的研究.pdf

1、第一部分人類胚胎形態(tài)學(xué)分型與線粒體拷貝數(shù)、胚胎直徑、膜電位及分布關(guān)系的研究
　　目的：線粒體作為胚胎發(fā)育所需能量的供應(yīng)源，所提供的能量直接影響著胚胎發(fā)育的潛能及胚胎的質(zhì)量。本研究主要探討人類不同時(shí)期及相同時(shí)期不同形態(tài)學(xué)分型的胚胎與自身線粒體拷貝數(shù)、胚胎直徑、膜電位及分布的關(guān)系及對(duì)胚胎發(fā)育的影響。
　　方法：選擇行IVF-ET不孕患者新鮮周期卵母細(xì)胞正常受精后發(fā)育較差不適合移植的胚胎152枚，和助孕成功妊娠后自愿丟棄的冷凍胚胎

2、305枚。對(duì)于冷凍的胚胎要進(jìn)行解凍復(fù)蘇，培養(yǎng)2h后放置倒置顯微鏡下觀察、拍照并進(jìn)行胚胎形態(tài)學(xué)的分期、分級(jí)評(píng)分，把相同時(shí)期評(píng)分相同的胚胎分成一組。根據(jù)胚胎發(fā)育時(shí)期不同，將所有冷凍胚胎分成D3冷凍胚胎組（卵裂期胚胎n=144）及D5冷凍胚胎組（囊胚n=161）。根據(jù)同濟(jì)生殖中心胚胎培養(yǎng)室的胚胎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，將卵裂期胚胎分為優(yōu)質(zhì)胚胎組（n=89）、非優(yōu)質(zhì)胚胎組（n=55）和新鮮胚胎組（不能移植的胚胎n=152），將冷凍囊胚分為優(yōu)質(zhì)囊胚組（n=10

3、1）和非優(yōu)質(zhì)囊胚組（n=60）。采用Real-time PCR檢測(cè)單個(gè)胚胎mtDNA拷貝數(shù)、熒光探針JC-10檢測(cè)胚胎線粒體△Ψm，熒光探針Mito Tracker Green對(duì)胚胎進(jìn)行染色觀察線粒體的分布。比較不同階段胚胎和相同階段不同質(zhì)量的胚胎與mtDNA拷貝數(shù)、胚胎直徑、△Ψm及線粒體分布的差異。
　　結(jié)果：
　　1、D3冷凍胚胎組mtDNA拷貝數(shù)明顯低于D5冷凍胚胎組（P＜0.05）；新鮮胚胎組mtDNA拷貝數(shù)明顯低

4、于D3冷凍優(yōu)質(zhì)胚胎組和D3冷凍非優(yōu)質(zhì)胚胎組（P＜0.05），而D3冷凍優(yōu)質(zhì)胚胎組mtDNA拷貝數(shù)與非優(yōu)質(zhì)胚胎組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；D5冷凍優(yōu)質(zhì)囊胚組mtDNA拷貝數(shù)明顯高于非優(yōu)質(zhì)囊胚組（P＜0.05）。
　　2、D3冷凍胚胎組直徑明顯低于D5冷凍胚胎組（P＜0.01），D3冷凍優(yōu)質(zhì)胚胎組直徑與非優(yōu)質(zhì)胚胎組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，D5冷凍優(yōu)質(zhì)囊胚組直徑明顯高于非優(yōu)質(zhì)囊胚組（P＜0.05）。
　　3、D3冷凍胚胎組線粒體△Ψm明顯低于D

5、5冷凍胚胎組（P＜0.05），新鮮胚胎組線粒體△Ψm明顯低于D3冷凍優(yōu)質(zhì)胚胎組和D3冷凍非優(yōu)質(zhì)胚胎組（P＜0.01，P＜0.05），D3冷凍優(yōu)質(zhì)胚胎組線粒體△Ψm高于非優(yōu)質(zhì)胚胎組（P＜0.05），D5冷凍優(yōu)質(zhì)囊胚組線粒體△Ψm明顯高于非優(yōu)質(zhì)囊胚組（P＜0.01）。
　　4、D3冷凍優(yōu)質(zhì)胚胎組的線粒體均勻分布于每個(gè)卵裂球內(nèi)，且染色均勻；而D3冷凍非優(yōu)質(zhì)胚胎組線粒體不均勻的分布在卵裂球內(nèi)，且卵裂球染色不均勻；新鮮胚胎組的線粒體彌散在胞

6、質(zhì)內(nèi)，且呈不均勻分布；D5冷凍優(yōu)質(zhì)囊胚組線粒體主要密集在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)核周圍較寬的區(qū)域，染色較深且均勻，而D5冷凍非優(yōu)質(zhì)囊胚組線粒體主要彌散在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)核周圍，染色較淺且不均勻。
　　結(jié)論：
　　1、隨著胚胎的不斷發(fā)育mtDNA拷貝數(shù)是逐漸增高，質(zhì)量越好胚胎mtDNA拷貝數(shù)越高。
　　2、D5冷凍胚胎組胚胎形態(tài)學(xué)分型越好的胚胎直徑越大，mtDNA拷貝數(shù)與胚胎直徑呈正相關(guān)。
　　3、隨著胚胎的不斷發(fā)育mt△Ψm是逐漸增高，

7、質(zhì)量越好的胚胎△Ψm越高。
　　4、線粒體均勻的分布在卵裂球和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)核周圍較寬的區(qū)域，胚胎有較好的發(fā)育潛能。
　　第二部分人類胚胎形態(tài)學(xué)分型與胚胎內(nèi)ATP、ROS及Ca2+水平關(guān)系的研究
　　目的：ATP是卵母細(xì)胞成熟、受精及胚胎發(fā)育的能量保證，ROS是胚胎內(nèi)重要的氧化還原信號(hào)分子，Ca2+是胚胎代謝活動(dòng)中重要的第二信使，三者均是線粒體的產(chǎn)物并存在密切的相互作用，并通過(guò)作用于線粒體而參與胚胎內(nèi)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡過(guò)

8、程。本研究主要探討人類不同時(shí)期及相同時(shí)期不同形態(tài)學(xué)分型的胚胎與胚胎內(nèi)ATP、ROS和Ca2+水平的關(guān)系及對(duì)胚胎發(fā)育的影響。
　　方法：選擇行IVF-ET不孕患者新鮮周期卵母細(xì)胞正常受精后發(fā)育較差不適合移植的胚胎152枚，和助孕成功妊娠后自愿丟棄的冷凍胚胎305枚。對(duì)于冷凍的胚胎要進(jìn)行解凍復(fù)蘇，培養(yǎng)2h后放置倒置顯微鏡下觀察、拍照并進(jìn)行胚胎形態(tài)學(xué)的分期、分級(jí)評(píng)分，把相同時(shí)期評(píng)分相同的胚胎分成一組。根據(jù)胚胎發(fā)育時(shí)期不同，將所有冷凍胚胎

9、分成D3冷凍胚胎組（卵裂期胚胎n=144）及D5冷凍胚胎組（囊胚 n=161）。根據(jù)同濟(jì)生殖中心胚胎培養(yǎng)室的胚胎評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，將卵裂期胚胎分為優(yōu)質(zhì)胚胎組（n=89）、非優(yōu)質(zhì)胚胎組（n=55）和新鮮胚胎組（不能移植的胚胎 n=152），將冷凍囊胚分為優(yōu)質(zhì)囊胚組（n=101）和非優(yōu)質(zhì)囊胚組（n=60）。采用熒光素酶法檢測(cè)單個(gè)胚胎ATP水平，活性氧檢測(cè)試劑盒檢測(cè)胚胎內(nèi)ROS的水平，鈣離子熒光探針檢測(cè)胚胎內(nèi)Ca2+水平，比較不同階段胚胎和相同階段不

10、同質(zhì)量的胚胎與胚胎內(nèi)ATP、ROS及Ca2+水平的差異。
　　結(jié)果：
　　1、D3冷凍胚胎組線粒體ATP明顯低于D5冷凍胚胎組（P＜0.05），新鮮胚胎組線粒體ATP低于D3冷凍優(yōu)質(zhì)胚胎組和D3冷凍非優(yōu)質(zhì)胚胎組（P＜0.05），D3冷凍優(yōu)質(zhì)胚胎組線粒體ATP高于非優(yōu)質(zhì)胚胎組（P＜0.05），D5冷凍優(yōu)質(zhì)囊胚組線粒體ATP明顯高于非優(yōu)質(zhì)囊胚組（P＜0.05）。
　　2、D3冷凍胚胎組線粒體ROS明顯低于D5冷凍胚胎組（P

11、＜0.05），新鮮胚胎組線粒體ROS高于D3冷凍優(yōu)質(zhì)胚胎組和D3冷凍非優(yōu)質(zhì)胚胎組（P＜0.01，P＜0.05），D3凍胚優(yōu)質(zhì)胚胎組線粒體ROS低于非優(yōu)質(zhì)胚胎組（P＜0.05），D5凍胚優(yōu)質(zhì)囊胚組線粒體ROS低于非優(yōu)質(zhì)囊胚組（P＜0.05）。
　　3、D3冷凍胚胎組線粒體Ca2+明顯低于D5冷凍胚胎組（P＜0.05），新鮮胚胎組線粒體Ca2+高于D3冷凍優(yōu)質(zhì)胚胎組和D3冷凍非優(yōu)質(zhì)胚胎組（P＜0.01，P＜0.05），D3凍胚優(yōu)質(zhì)胚胎