li-Key和PEP-1攜帶異種病毒表位嵌合疫苗的構建及其體液免疫效應.pdf

1、跨膜糖蛋白恒定鏈（invaria nt china, Ii）在抗原遞呈細胞內主要參與主要組織相容性復合體（MHC）Ⅱ類分子與抗原肽復合物的裝配，其關鍵活性基團（Ii-Key）在此過程中發(fā)揮重要作用。近些年，Ii-Key已被證實能夠攜帶單一抗原或抗原肽，有效增強細胞免疫和體液免疫。PEP-1是一種人工設計的細胞膜穿透肽（Cell penetrating peptide, CPP），具有克服細胞膜的屏障作用跨膜轉導能力，以非能量、非受體依賴

2、性的方式把蛋白質、肽段、寡核苷酸等跨膜轉導入各種細胞的胞漿和胞核內。本文基于Ii-Key和PEP-1載體上構建異源多表位串聯(lián)肽新型疫苗，為雙重防控雞傳染性法氏囊?。↖nfectious Bursal Disease，IBD）和新城疫（Newcastle disease, ND）提供參考。
　　首先，本文構建了Ii-Key與雞傳染性法氏囊病病毒VP2肽表位（aa197-209）和新城疫病毒HN肽表位（aa345-353）的嵌合體，并

3、將嵌合體基因插入pET-32a原核表達載體，轉化E.coli Rose tta通過IPTG誘導表達，用鎳柱親和層析純化融合蛋白，免疫SPF級BAL b/c小鼠，分別通過間接酶聯(lián)免疫吸附試驗和免疫印記試驗檢測小鼠體內的抗體水平和融合蛋白的反應原性。結果表明，與VP2/HN串聯(lián)表位對照組相比較，Ii-Key/VP2/HN嵌合體疫苗處理組抗體效價平均提高了13.7倍。
　　其次，將PEP-1和PEP-1-Ii-Key串聯(lián)載體分別與VP2

4、/HN表位連接構建嵌合體（PEP-1/VP2/HN和PEP-1-Ii-Key/VP2/HN），通過原核表達，融合蛋白的純化，小鼠免疫和間接-ELISA檢測抗體效價等方法，研究PEP-1和PEP-1-Ii-Key聯(lián)合載體對VP2/HN串聯(lián)肽免疫效應的影響。結果表明，與單純VP2/HN串聯(lián)肽組相比，均能有效刺激機體產生抗體（8.6和6.7倍，p<0.05）。但同時也發(fā)現(xiàn)，PEP-1-Ii-Key聯(lián)合載體免疫增強效應明顯低于Ii-Key載體組

5、（p<0.05），表明PEP-1對Ii-Key免疫增強效應發(fā)揮負向調控作用。
　　為了探究Ii-Key和PEP-1免疫增效作用是否與MHCⅡ類分子相互作用的加強有關，本文在構建的原核重組質?；A上，構建了真核表達載體 pmCherry-C1與VP2/HN、Ii-Key/VP2/HN、PEP-1/VP2/HN、PEP-1/Ii-Key/VP2/HN真核重組質粒，與實驗室保存的pEGFP-N1-MHCⅡα真核重組質粒轉化大腸桿菌DH5

6、α，使用無內毒質粒抽提試劑盒抽提后取適量重組質粒通過脂質體Lipofectamine TM2000轉染293T細胞，轉染24h后使用激光共聚焦顯微鏡下觀察定位情況。結果表明，各處理組均能在胞內與MHCⅡ類分子發(fā)生共定位，但是各組間差異不明顯。表明Ii-Key和PEP-1免疫增效作用與其是否增加了VP2/HN表位肽與MHCⅡ的相互作用沒有明顯關聯(lián)。
　　綜上所述，本文成功構建了VP2/HN與Ii-Key或PEP-1嵌合體，發(fā)現(xiàn)單個載