乙型肝炎病毒細(xì)胞核轉(zhuǎn)位動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及HBV cccDNA熒光定量PCR分析研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)的生活周期可以分成以下幾個(gè)階段:病毒黏附宿主細(xì)胞;病毒穿透細(xì)胞膜,進(jìn)入細(xì)胞;釋放病毒基因組;表達(dá)病毒基因產(chǎn)物;復(fù)制病毒基因組;組裝病毒病毒顆粒;釋放病毒.該研究第一部分采用細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)和同位素示蹤技術(shù)分析HBV核衣殼蛋白、基因組在HBV侵入肝細(xì)胞過程中的定位及動(dòng)態(tài)變化,并闡明在HBV穿越細(xì)胞核膜過程中,核衣殼蛋白是否需要先蛻去這個(gè)問題.HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(covalent

2、ly closed circular,cccDNA)是HBV復(fù)制過程中最為關(guān)鍵的中間體形態(tài).HBV基因組在聚合酶作用下將部分雙鏈開環(huán)結(jié)構(gòu)補(bǔ)足成完整雙鏈開環(huán)結(jié)構(gòu),然后在細(xì)胞核內(nèi)連接酶作用下把雙鏈中原先存在的缺口補(bǔ)平,形成共價(jià)閉合環(huán)狀DNA結(jié)構(gòu),也就是cccDNA.HBV cccDNA在細(xì)胞核內(nèi)RNA聚合酶作用下,轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生多種RNA,其中中間體RNA是形成子代HBV Dane顆粒前提RNA.從病毒生活周期分析,HBV cccDNA是病毒復(fù)制

3、以及致病機(jī)理的關(guān)鍵所在.此外,HBV cccDNA可與細(xì)胞核內(nèi)的核蛋白結(jié)合,形成穩(wěn)定的微染色體(mini-chromosome)結(jié)構(gòu),抗病毒藥物很難清除它.由于肝細(xì)胞往往處在細(xì)胞復(fù)制周期的G<,0>期,降解HBV cccDNA很難,所以它的自然半衰期就比較長(zhǎng).除HBV基因組整合外,目前臨床應(yīng)用的抗HBV藥物和正在研究的治療乙肝藥物的最迫切需要解決的就是消除HBV cccDNA,但是目前沒有便捷、準(zhǔn)確、靈敏度高的方法可以供臨床動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)HB

4、V cccDNA.Southen blot是檢測(cè)HBV cccDNA的經(jīng)典方法,但是該方法過程比較復(fù)雜,操作可控性比較差,而且靈敏度不高.Addison等發(fā)展了一種能相對(duì)定量DHBV的競(jìng)爭(zhēng)PCR方法,雖然該方法靈敏度有了提高,但是在整個(gè)操作過程中仍需進(jìn)行凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜和<'32>p標(biāo)記的同位素探針雜交.PCR技術(shù)是非常靈敏、便捷的方法,但是由于HBV cccDNA與其它HBV DNA形態(tài)非常接近,很難設(shè)計(jì)出僅僅擴(kuò)增HBV cccDNA而