不同早期液體復(fù)蘇方案及氫氣吸收對脂多糖誘導(dǎo)膿毒性休克大鼠肺臟及小腸的作用.pdf

1、目的：
　　 膿毒性休克(septic shock)，因可造成多器官功能障礙或衰竭而具有極高的病死率，一直備受醫(yī)學(xué)界關(guān)注。早期液體復(fù)蘇是逆轉(zhuǎn)膿毒性休克有效循環(huán)血量不足、防治多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndyome，MODS)的重要和必要手段。急性肺損傷（acute lung injury, ALI）是膿毒性休克最常見的并發(fā)癥，雖然有臨床試驗(yàn)報道早期液體復(fù)蘇能改善膿毒性休克合并A

2、LI患者的預(yù)后，但也有研究稱大量補(bǔ)液可使液體在組織間隙儲留而加重休克患者的肺損傷，那么對膿毒性休克合并ALI的患者，如何進(jìn)行液體管理成為許多臨床醫(yī)生的困擾。治療膿毒性休克傳統(tǒng)的補(bǔ)液方法為在擴(kuò)充血容量基礎(chǔ)上，若不能維持有效灌注壓再應(yīng)用血管活性藥物，而最近有研究報道在補(bǔ)液同時應(yīng)用升壓藥-去甲腎上腺素，能明顯降低達(dá)到目標(biāo)血壓的補(bǔ)液量，在保證中心灌注壓的同時對末梢循環(huán)也有改善作用。但其對肺功能的影響未見報道。
　　 氧化應(yīng)激損傷是膿毒性

3、休克重要發(fā)病機(jī)制之一，目前臨床上尚無特效的抗氧化治療藥物。前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)在LPS誘導(dǎo)膿毒性休克致ALI發(fā)生的過程中，存在嚴(yán)重的氧自由基損傷，而且早期液體復(fù)蘇對肺臟的氧化應(yīng)激損傷無明顯改善作用。最近研究證實(shí)低濃度氫可以選擇性中和羥自由基，改善氧化應(yīng)激損傷，而且在缺血-再灌注損傷、炎性疾病、代謝性疾病、神經(jīng)性疾病等動物模型中，氫分子都顯示了較好的治療效果。目前，氫氣作為抗氧化劑在膿毒性休克領(lǐng)域研究甚少。
　　 膿毒性休克時為了

4、保證心、腦等重要器官的供血，血流出現(xiàn)重新分配，胃腸道的血流量較體循環(huán)減少更為明顯，可出現(xiàn)嚴(yán)重的缺血、缺氧及再灌注損傷。胃腸道粘膜的損傷可激活大量炎性介質(zhì)的釋放，形成炎癥介質(zhì)的“瀑布效應(yīng)”，最終導(dǎo)致MODS的發(fā)生。因此保護(hù)膿毒性休克過程中腸道功能，對改善膿毒性休克患者的預(yù)后具有重要意義。在前期實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)早期液體復(fù)蘇聯(lián)合2％氫氣吸入對膿毒性休克中肺損傷具有明顯的改善作用，但這種干預(yù)手段對腸道功能的作用尚未見報道。
　　 因此本實(shí)

5、驗(yàn)將利用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)膿毒性休克致ALI大鼠模型，研究兩種不同的早期液體復(fù)蘇方案對肺功能的影響，從肺損傷角度評價早期與延遲應(yīng)用去甲腎上腺素的液體復(fù)蘇方案對膿毒性休克大鼠肺臟的作用;將早期液體復(fù)蘇與2％氫氣吸入作為聯(lián)合干預(yù)手段，系統(tǒng)研究其在LPS誘導(dǎo)膿毒性休克過程中，在炎性介質(zhì)、細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等方面對肺臟和小腸功能的影響。
　　 材料與方法
　　 1、膿毒癥休克模型建立
　　 健康雄性Wistar大鼠(1

6、80～200g)，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部提供。75只Wistar大鼠隨機(jī)分成5組，正常對照組（A組，n=15），膿毒性休克對照組(B組，n=15)，傳統(tǒng)液體復(fù)蘇方案組（C組，n=15），早期應(yīng)用去甲腎上腺素組(D組，n=15)，早期液體復(fù)蘇+2％氫氣吸入組（E組，n=15）。10％水合氯醛(300mg/kg)經(jīng)腹腔麻醉，氣管切開接呼吸機(jī)輔助通氣，呼吸頻率100次/分，潮氣量10 ml/kg，A，B，C，D組吸入氣體為空氣，E組吸入氣體

7、為2％氫空混合氣。左頸動脈穿刺，經(jīng)壓力傳感器連接監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測心率及平均動脈壓(MAP);股靜脈穿刺留置導(dǎo)管，以備給藥及補(bǔ)液，電熱器維持體溫。除A組外，其余4組LPS15mg/kg緩慢靜脈注射，建立膿毒性休克大鼠模型。
　　 2、方法
　　 (1)實(shí)驗(yàn)一:正常對照組（A組，n=15），膿毒性休克對照組（B組，n=15），傳統(tǒng)液體復(fù)蘇方案組（C組，n=15），早期應(yīng)用去甲腎上腺素組（D組，n=15）。C組液體復(fù)蘇方案:生理鹽水

8、10ml/kg/15min，30min后根據(jù)MAP水平，應(yīng)用去甲腎上腺素(0.5-6μg/kg/min)，D組液體復(fù)蘇方案:生理鹽水10ml/kg/15min，同時應(yīng)用去甲腎上腺素(0.5-6μg/kg/min)，維持MAP于正常水平。記錄各組的生命體征、補(bǔ)液量及去甲腎上腺素的用量。模型建立2h后經(jīng)頸動脈放血處死。留取動脈血行血?dú)夥治觯谓M織HE染色，光鏡下觀察病理改變，透射電鏡觀察肺組織超微結(jié)構(gòu)變化，檢測肺組織中氧化還原指標(biāo)(MDA、

9、MPO、SOD)，ELISA檢測血清和肺泡灌洗液中促炎介質(zhì):IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)水平。
　　 (2)實(shí)驗(yàn)二:正常對照組（A組，n=15），膿毒性休克對照組（B組，n=15），早期液復(fù)蘇組（C組，n=15），早期液體復(fù)蘇+2％氫氣吸入組（E組，n=15）。10％水合氯醛(300mg/kg)經(jīng)腹腔麻醉，氣管切開接呼吸機(jī)輔助通氣，呼吸頻率100次/分，潮氣量10 ml/kg， E組吸入氣體為2％氫空混合氣，其余3組吸入氣

10、體為空氣。左頸動脈穿刺，連接監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測心率及平均動脈壓(MAP);股靜脈穿刺留置導(dǎo)管，以備給藥及補(bǔ)液，電熱器維持體溫。除A組外，其余3組LPS15mg/kg緩慢靜脈注射，建立膿毒性休克大鼠模型。液體復(fù)蘇方案:生理鹽水10ml/kg/15min，30min后根據(jù)MAP水平，應(yīng)用去甲腎上腺素（0.5-6μg/kg/min），維持MAP于正常水平。記錄各組的生命體征、補(bǔ)液量及去甲腎上腺素的用量。
　　 模型建立成功后2h經(jīng)頸靜脈放血處

11、死，留取動脈血行血?dú)夥治觯琀E染色觀察肺組織病理改變，免疫組化觀察Fas及Bcl-2在肺組織中的表達(dá)，Western-blot對肺組織中的Fas及Bcl-2進(jìn)行半定量檢測，檢測肺組織中氧化還原指標(biāo)(MDA、MPO、SOD)的表達(dá)，ELISA檢測肺泡灌洗液中促炎介質(zhì):IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)水平。
　　 (3)實(shí)驗(yàn)三:正常對照組(A組，n=15)，膿毒性休克對照組（B組，n=15），早期液復(fù)蘇組（C組，n=15），早期液

12、體復(fù)蘇+2％氫氣吸入組（E組，n=15）。E組吸入氣體為2％氫空混合氣，其余3組吸入氣體為空氣。液體復(fù)蘇方案:生理鹽水10ml/kg/15min，30min后根據(jù)MAP水平，應(yīng)用去甲腎上腺素(0.5-6μg/kg/min)，維持MAP于正常水平。記錄各組的生命體征、補(bǔ)液量及去甲腎上腺素的用量。大鼠于模型建立成功后2h，經(jīng)頸動脈放血處死，留取動脈血行血?dú)夥治觥Ａ羧⌒∧c標(biāo)本，HE染色觀察小腸病理改變，并應(yīng)用Chiu評分對小腸進(jìn)行病理損傷半定

13、量評分，透射電鏡觀察小腸細(xì)胞器改變情況，TBA法檢測小腸組織中MDA、MPO表達(dá)，鄰聯(lián)二回香胺顯色劑法檢測血清DAO表達(dá)，ELISA檢測血清中IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)水平。
　　 3、統(tǒng)計學(xué)分析
　　 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)（(x)±s）差表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用pearson檢驗(yàn)，P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、實(shí)驗(yàn)一

14、>　　 (1)補(bǔ)液量及血?dú)饨Y(jié)果:早期應(yīng)用去甲腎上腺素（D組）與傳統(tǒng)補(bǔ)液方案(C組)比較明顯減少了達(dá)到目標(biāo)血壓所需的補(bǔ)液量，使氧合指數(shù)進(jìn)一步改善，同時降低了血乳酸水平，組間二氧化碳分壓值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 (2) HE染色和電鏡結(jié)果顯示早期應(yīng)用去甲腎上腺素（D組）使肺水腫程度明顯減輕，肺組織中炎性細(xì)胞侵潤程度、肺泡充血情況及Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞的損傷程度均得到明顯改善。
　　 (3)早期應(yīng)用去甲腎上腺素（D組）和傳

15、統(tǒng)補(bǔ)液方案（C組）均使血清和BALF中的促炎介質(zhì):IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)水平下調(diào)，但早期應(yīng)用去甲腎上腺素使促炎介質(zhì)表達(dá)下降更為明顯，與傳統(tǒng)補(bǔ)液比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;兩種補(bǔ)液方案對IL-6、IL-8、TNF-α在BALF和血清中的比值無影響。
　　 (4)早期應(yīng)用去甲腎上腺素（D組）僅使MPO表達(dá)較傳統(tǒng)補(bǔ)液組及休克對照組明顯下降，早期應(yīng)用去甲腎上腺素（D組）和傳統(tǒng)補(bǔ)液方案（C組）對SOD和MDA表達(dá)均無明顯改善。

16、r>　　 2、實(shí)驗(yàn)二
　　 (1)早期液體復(fù)蘇聯(lián)合2％氫氣吸入與單純液體復(fù)蘇比較降低了達(dá)到目標(biāo)血壓所需的液體量和去甲腎上腺素的用量;兩種復(fù)蘇方案均使血氧分壓得到明顯提高，降低了血乳酸水平，提高血PH值，氫氣吸入聯(lián)合液體復(fù)蘇較單純液體復(fù)蘇對上述指標(biāo)改善更為明顯，組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;各組間二氧化碳分壓值比較無顯著差異。
　　 (2)膿毒性休克致ALI過程中氧化應(yīng)激損傷嚴(yán)重，單純液體復(fù)蘇對氧化應(yīng)激損傷改善不明顯（MD

17、A、MPO、SOD無明顯變化）;早期液體復(fù)蘇聯(lián)合2％氫氣干預(yù)明顯降低了MDA、MPO表達(dá)水平，使SOD表達(dá)增加，減輕了氧化應(yīng)激損傷。
　　 (3)早期液體復(fù)蘇聯(lián)合2％氫氣吸入與單純液體復(fù)蘇比較使肺W/D值明顯下降，HE染色結(jié)果提示前者明顯減輕了肺泡壁水腫情況，使肺組織病理損傷得到改善。
　　 (4)免疫組化和Western-blot檢測結(jié)果提示，LPS致膿毒性休克過程中肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡明顯增加，表現(xiàn)在F

18、as表達(dá)增加而Bcl-2表達(dá)減少，兩種復(fù)蘇方案均使肺組織凋亡情況有所改善，但早期液體復(fù)蘇聯(lián)合2％氫氣吸入比單純液體復(fù)蘇對肺組織細(xì)胞凋亡的改善情況更明顯，組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 (5)早期液體復(fù)蘇聯(lián)合2％氫氣吸入與單純液體復(fù)蘇比較進(jìn)一步降低了BALF中促炎介質(zhì):IL-6、IL-8、TNF-α的表達(dá)，組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 3、實(shí)驗(yàn)三
　　 (1)小腸HE染色結(jié)果提示休克對照組小腸絨毛水腫明顯

19、，大量粘膜上皮細(xì)胞脫落，絨毛和腺體明顯受損，伴有中性粒細(xì)胞侵潤，有的出現(xiàn)潰瘍，小腸上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)改變，腸壁水腫，Chiu評分明顯高于正常對照組;早期液體復(fù)蘇組與休克對照組比較，上述損傷進(jìn)一步加重，Chiu評分進(jìn)一步升高;早期液體復(fù)蘇聯(lián)合2％氫氣吸入組上述小腸損傷情況明顯減輕，Chiu評分明顯降低，組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 (2)電鏡結(jié)果提示早期液體復(fù)蘇聯(lián)合2％氫氣吸入與單純液體復(fù)蘇比較細(xì)胞器損傷情況明顯減輕。
　　

20、 (3)膿毒性休克組腸組織中MDA、MPO活力明顯高于正常對照組(P＜0.05);早期液體復(fù)蘇組使MDA、MPO活力進(jìn)一步升高(P＜0.05);早期液體復(fù)蘇聯(lián)合2％氫氣吸入組腸組織中MDA、MPO活力較膿毒性休克組和早期液體復(fù)蘇組均明顯下降(P＜0.05)。
　　 (4)休克對照組中血清IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)水平較正常對照組明顯升高(P＜0.05);早期液體復(fù)蘇使促炎介質(zhì)(IL-6、IL-8、TNF-α)水平降低(

21、P＜0.05);早期液體復(fù)蘇聯(lián)合2％氫氣吸入組與單純液體復(fù)蘇比較進(jìn)一步降低了血清中促炎介質(zhì)表達(dá)水平(P＜0.05)。
　　 (5)休克對照組中血清DAO表達(dá)水平較正常對照組明顯升高（6.54±0.68 vs4.32±0.33，P＜0.05）;早期液體復(fù)蘇組使DAO水平進(jìn)一步升高（6.89±0.77 vs6.54±0.68，P＜0.05）;早期液體復(fù)蘇聯(lián)合2％氫氣吸入組腸組織中血清DAO水平較膿毒性休克組和早期液體復(fù)蘇組均明顯下降

22、（5.14±0.44 vs6.54±0.68;5.14±0.44 vs6.89±0.77,P＜0.05）。
　　 (6)休克對照組中小腸Chiu評分與血清IL-6、IL-8、TNF-α表達(dá)，小腸氧化損傷指標(biāo)(MDA、MPO)、血清DAO及血乳酸值線性相關(guān)分析結(jié)果提示Chiu評分與各檢測指標(biāo)有正相關(guān)趨勢，但與MDA和血乳酸水平的相關(guān)性具有統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.001和P＜0.001），且與血乳酸值的相關(guān)系數(shù)最大(r=0.973)。<

23、br>　　 結(jié)論：
　　 1、實(shí)驗(yàn)一
　　 (1) LPS誘導(dǎo)膿毒性休克大鼠早期就并發(fā)急性肺損傷;
　　 (2)傳統(tǒng)液體復(fù)蘇方案保證了有效的循環(huán)血量及組織灌注壓，改善了微循環(huán)障礙，使氧分壓及氧合指數(shù)升高，但卻有加重肺水腫的趨勢;
　　 (3)早期應(yīng)用去甲腎上腺素與傳統(tǒng)液體復(fù)蘇方案比較，在保證了有效的循環(huán)血量及組織灌注壓，改善了微循環(huán)障礙的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步減少了復(fù)蘇所需液體量，使肺水腫程度減輕，減少了肺泡灌

24、洗液及血漿中促炎介質(zhì)表達(dá)水平，使氧合指數(shù)進(jìn)一步升高，對肺損傷具有保護(hù)作用;
　　 (4)早期液體復(fù)蘇對膿毒性休克致肺損傷過程中氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)改善不明顯。
　　 2、實(shí)驗(yàn)二
　　 早期液體復(fù)蘇聯(lián)合2％氫氣吸入與單純液體復(fù)蘇比較:
　　 (1)減少了膿毒性休克復(fù)蘇過程中達(dá)到目標(biāo)血壓所需的液體量，減輕了肺水腫，改善了肺氧合指數(shù);
　　 (2)減輕了膿毒性休克致ALI過程中肺組織氧化應(yīng)激損傷程度;

25、>　　 (3)降低了肺泡灌洗液中促炎介質(zhì)（IL-6、IL-8、TNF-α）的過度表達(dá)，減輕過度炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的肺損傷;
　　 (4)使肺組織中促凋亡蛋白Fas表達(dá)減少，抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)增加，減輕了肺組織細(xì)胞的凋亡，減輕了肺損傷程度，保護(hù)了肺功能。
　　 3、實(shí)驗(yàn)三
　　 (1) LPS致膿毒性休克過程中小腸功能受到嚴(yán)重?fù)p傷，表現(xiàn)為粘膜機(jī)械屏障損傷、氧化應(yīng)激損傷和炎性介質(zhì)的大量釋放;
　　 (2)

26、早期液體復(fù)蘇雖然使血漿中促炎介質(zhì):TNF-α、 IL-6和IL-8水平下降，但卻加重了小腸粘膜屏障和氧化應(yīng)激損傷;
　　 (3)早期液體復(fù)蘇聯(lián)合2％氫氣吸入治療既降低了血漿中促炎介質(zhì)水平，又減輕了膿毒性休克過程中小腸機(jī)械粘膜和氧化應(yīng)激損傷，從不同層面保護(hù)了腸道功能;
　　 (4)血清炎性介質(zhì)水平并不能完全、準(zhǔn)確反映休克過程中腸道局部損傷程度，血乳酸值與小腸損傷程度具有明顯相關(guān)性，因其操作簡單、快捷及無創(chuàng)傷性更適合用于評估