強旱生植物沙冬青AmDHN、AmERF基因克隆及轉化甜菜的研究.pdf

1、甜菜是世界上重要的糖料作物之一，也是我國第二大糖料作物，在我國國民生產(chǎn)總值中占有重要地位。本試驗是在已對強早生植物沙冬青eDNA文庫研究的基礎上，通過EST序列分析和GEN-BANK核酸數(shù)據(jù)庫的比對，對檢測到的34個DIN基因ESTs和15個ERF的ESTs進行拼接得到基因全長的cDNA序列，通過設計特異性引物克隆了沙冬青AmDHN基因和AmERF轉錄因子，構建了沙冬青AmDHN基因植物表達載體和沙冬青AmDHN基因、AmERF轉錄因子

2、及PPT抗性基因二價植物表達載體，建立了甜菜組培再生體系，利用農(nóng)桿菌介導法將沙冬青AmDHN基因導入甜菜，并進行了功能驗證。主要研究結果入如下：
　　 1．克隆了沙冬青脫水素(AmDHN)基因，其全長為1106bp，讀碼框為552bp，編碼183個氨基酸，理論MW=18407.4，理論pI=6.22。
　　 2．克隆了沙冬青乙烯應答轉錄因子(AmERF)，其讀碼框為633bp，編碼211個氨基酸，理論MW=23216.0

3、，理論pI=8.20。網(wǎng)絡Blastx程序比對，找到56個同源性較高的序列，其中與擬南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻粳稻品種組(japonicacultivar-group of Oryza sativa)、辣椒(Capsicum annuum)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)的一致性分別達到83％、72％、74％和61％。
　　 3．利用PCR定點突變技術對AmDHN基因的1個堿基進行了

4、定點突變，成功地將其堿基序列CCATGG突變?yōu)镃TATGG。
　　 4．構建了沙冬青的AmDHN基因植物表達載體pCAMBIA3301-DHN與AmDHN基因、AmERF轉錄因子的二價植物表達載體pCAMBIA3301-DHN、AmERF，為今后進一步研究沙冬青抗逆基因的表達規(guī)律及代謝調(diào)控等提供了基礎，同時也豐富了利用轉基因技術提高作物抗逆性的基因庫。
　　 5．建立了以甜菜葉柄為外植體的遺傳轉化再生體系，篩選出誘導叢生

5、芽能力較高的甜菜基因型材料4個(N98122、N9849、HBB-1和內(nèi)甜單1)，分化誘導培養(yǎng)基2種(MS+NAA0.5mg/L+6-BA1.5mg/L；MS+NAA0.5mg/L+KT3.0mg/L)，生根誘導培養(yǎng)基1種(MS+NAA2.0mg/L)。
　　 6．采用農(nóng)桿菌介導法并結合真空輔助侵染將脫水素基因導入了甜菜，獲得經(jīng)PCR檢測陽性轉基因植株107株，PPT抗性檢測結果顯示轉基因植株具有很強的PPT抗性，干旱脅迫試驗結