循環(huán)miR-189對系統(tǒng)性紅斑狼瘡的臨床診斷價值和意義.pdf

1、系統(tǒng)性紅斑狼瘡（Systemic lupus erythematosus，SLE）是一種自身免疫性疾病，好發(fā)于育齡女性，而且老人和小孩的病例也有相關(guān)報道。但是，迄今為止，它的發(fā)病機制還不是很清楚。根據(jù)有關(guān)研究分析，可能的發(fā)病因素包括遺傳、環(huán)境、藥物及自身免疫系統(tǒng)功能的紊亂。涉及到的自身免疫功能紊亂主要體現(xiàn)在T、B 淋巴細胞比例的改變及功能的過度激活，產(chǎn)生的多種自身抗體與自身反應(yīng)性淋巴細胞和自身抗原反應(yīng)，造成組織損傷和正常功能破壞，引起疾

2、病的發(fā)生和發(fā)展。SLE是多器官、多組織損傷的疾病。臨床表現(xiàn)多樣，既可以系統(tǒng)出現(xiàn)，也可以某一臨床特征為突出特點，往往被誤診為其他疾病予以治療，延誤了疾病的早期治療，加快疾病的發(fā)展，造成組織和器官不可逆的損傷?？紤]到SLE 病理損害與臨床表現(xiàn)方面的特征，臨床對其診斷標準主要依據(jù)臨床表現(xiàn)和實驗室診斷，特別是實驗室診斷對疾病的診斷和治療療效評價具有不可替代的關(guān)鍵作用。高靈敏性、高通量的快速篩查技術(shù)有利于實驗室診斷項目的開展和擴大，有利于疾病早期

3、發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療。目前實驗室對SLE和其他自身免疫性疾病篩查的主要項目是自身抗體譜的檢測，包括抗雙鏈DNA抗體（double standDNA，dsDNA）、抗單鏈DNA抗體（singAlstand DNA，ssDNA）、抗核抗體（anti-nuclearantibody，ANA）、抗可提取性核抗原（extractable nucler antigen，ENA）等?？筪sDNA抗體是SLE 最重要的診斷標志之一，dsDNA與相應(yīng)

4、自身抗體形成的免疫復(fù)合物可導(dǎo)致皮下組織、腎臟和其它器官的損傷，而且自身抗體滴度與疾病的活動具有相關(guān)性。此外，SLE的另一個標志物抗史密斯（Smith，Sm）抗體也被認為參與了病理過程。雖然這兩種自身抗體均具有較高特異性，但是敏感性都比較低，在臨床應(yīng)用上存在不足。所以目前已有很多研究正致力于探索特異性和可靠性更強的分子診斷標記物作為自身抗體譜的補充或替代應(yīng)用于SLE的診斷。microRNA （miRNA）是大小約19-23個堿基的非編碼單

5、鏈小分子RNA，通過與靶基因3' 端非翻譯區(qū)（3'-UTR）的不完全堿基配對發(fā)揮基因調(diào)控的作用，抑制mRNA的翻譯。miRNA 廣泛參與了生物體多種生理和病理過程，包括細胞增殖、分化、凋亡、應(yīng)激反應(yīng)和腫瘤生成等，通過表達量的上調(diào)或下調(diào)影響細胞的發(fā)育和疾病過程。一些miRNAs的表達譜具有細胞或組織特異性，而且在疾病發(fā)生時它們的表達量也發(fā)生特定的改變。最近有文獻報道外周血循環(huán)miRNA 可以作為腫瘤、心肌梗死、肝臟損傷等標記物的研究，與疾

6、病進程有密切關(guān)系。miRNA不同于其他小分子RNA，正常情況下表達量相對恒定，在血漿和血清中非常穩(wěn)定，不易被血液中的RNA 酶降解，在反復(fù)凍融和長期儲存的情況下仍能保持穩(wěn)定?；谂R床的需要和miRNA的特殊性質(zhì)，臨床是否可以用miRNA作為SLE的診斷標志物達到輔助診斷的目標？因此，本研究旨在檢測miRNA189(miR-189)在外周血中表達量的變化以及探討其對系統(tǒng)性紅斑狼瘡的診斷價值和意義。
　　 研究目的：探討血漿中miR

7、-189在SLE組和對照組間的表達量是否存在差異，以及循環(huán)miR-189對SLE潛在的診斷價值，是否可彌補自身抗體譜對SLE 診斷和療效評價中的不足。
　　 研究方法：1. 自身抗體的檢測對收集的三組血標本進行自身抗體譜的檢測，主要采用免疫的方法，其中抗dsDNA、抗ssDNA 檢測采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（Enzyme LinkedImmunoadsorbentassay，ELISA）間接法，抗ENA 檢測采用免疫印跡法，ANA

8、檢測采用間接免疫熒光法，按照操作說明檢測并觀察結(jié)果。2. 外周血miR-189的定量收集SLE患者血漿為疾病組(n=50)，包括穩(wěn)定期（n=13）和活動期（n=37）。設(shè)立正常健康對照組（n=24）和疾病對照組（n=25），正常對照組為健康體檢者，排除自身免疫性疾病和機體各器官的器質(zhì)性病變；疾病對照組為各類自身免疫性疾病患者，包括白塞病（Behcet Disease，BD）（n=2），系統(tǒng)性硬化癥（System Sclerosis，SS

9、c）(n=1)，干燥綜合征（Sjogren's Disease，SS）(n=1)，多發(fā)性肌炎/皮肌炎（Polymyositis/ Dermatomyositis，PM/DM）(n=4)，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RheumatoidArthritis，RA）(n=7)，強直性脊柱炎（Ankylosing Spondylitis，AS）(n=5)，混合結(jié)締組織?。∕ixed Connective Tissue Disorder，MCTD）(n=5)。

10、各組之間年齡和性別統(tǒng)計無差異。采用ABI 公司研制RNA 抽提試劑盒抽提標本總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，利用TaqMan 探針進行Real-time PCR 相對定量檢測，比較觀察三組miR-189的表達量變化。
　　 實驗結(jié)果：1．三組人群中抗體陽性率比較對ANA、抗dsDNA、抗Sm、抗Rnp和AnuA在三組人群中的陽性率進行統(tǒng)計，SLE組中這五種抗體陽性率分別為98％、42％、28％、18％和24％，疾病對照組中陽性率為

11、19％、4％、0％、2％和1％，正常對照組均為0％。這五種抗體在SLE中的特異度分別為24％、84％、100％、92％和96％。實驗結(jié)果顯示抗dsDNA、抗Sm、抗Rnp和AnuA 特異性高，敏感性低，ANA 敏感性高，特異性低。2．三組人群中血漿miR-189表達量比較SLE組、疾病對照組、正常對照組三組血漿miR-189表達量比較，SLE組(26.8713±23.1291)高于疾病對照組（5.2281±4.4251）和正常對照組（3

12、.9908±4.0281），P值分別為0.0001，有統(tǒng)計學(xué)差異，兩對照組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。SLE組穩(wěn)定期（34.8932±27.4931）高于活動期（24.0528±21.0898），p值為0.2885，統(tǒng)計學(xué)無差異。3. miR-189的相對定量與相關(guān)系數(shù)miR-189的相對定量（RQ）與SLE患者SLEDAI 評分的相關(guān)系數(shù)為r=0.009、p=0.968；miR-189的RQ與潑尼松使用劑量相關(guān)性系數(shù)為r=-0.2376、p=0

13、.1831；miR-189的RQ與抗ds-DNA 滴度相關(guān)系數(shù)為r=0.2607、p=0.2484，都沒有直接的相關(guān)性。4. miR-189對SLE的診斷價值分析與正常對照組比較，miR-189對SLE的診斷價值分析：ROC 曲線下面積0.888，面積標準誤為0.036，RQ 用于診斷SLE 有顯著意義（p=0.000），RQ值越大，診斷SLE的可能性越大。面積的95％可信區(qū)間(CI)為（0.817-0.960），不包括0.5。因此具有

14、診斷價值意義。miR-189對其他風(fēng)濕性疾病的診斷價值：ROC 曲線下面積為0.583，標準誤為0.083。曲線與對角線重合，對其他風(fēng)濕性疾病沒有診斷價值。SLE組與疾病對照組比較，miR-189對SLE的鑒別診斷價值分析：ROC 曲線下面積0.847，面積標準誤0.043，RQ 用于鑒別診斷有顯著意義（p=0.000）。
　　 實驗結(jié)論：1．目前臨床上主要采用自身抗體譜對自身免疫性疾病包括SLE 達到臨床輔助診斷，從檢測結(jié)果看

15、自身抗體在敏感性和特異性達不到統(tǒng)一，敏感性高、特異性低則鑒別診斷不足而易誤診，特異性高、敏感性低則診斷效率差而易漏診，在臨床輔助診斷應(yīng)用上存在明顯的不足和缺陷。2．血漿游離miR-189在敏感性和特異性能達到相對統(tǒng)一，可以作為一個SLE的潛在診斷標志物。雖然miR-189在SLE 活動期和穩(wěn)定期都升高，表明該指標對評價患者的疾病狀態(tài)和嚴重程度無輔助診斷價值，但可以用來補充現(xiàn)有實驗室診斷指標的不足，有助于SLE的早期診斷，使病人得到合理正