人工設(shè)計(jì)的PPR蛋白特異識(shí)別靶標(biāo)RNA的機(jī)制研究.pdf

1、PPR(pentatricopeptide repeat protein)蛋白是近年發(fā)現(xiàn)的一類RNA結(jié)合蛋白家族，從原生生物、藻類到陸生植物和哺乳動(dòng)物等均有分布，尤其在陸生植物中分布最多，例如擬南芥中含有450多種。PPR蛋白由核基因編碼并主要定位到線粒體或葉綠體中發(fā)揮作用，參與RNA的轉(zhuǎn)錄、剪接、編輯和翻譯等多種代謝途徑。它們在植物的電子呼吸鏈傳遞、光合作用、生長發(fā)育以及育性恢復(fù)等過程中發(fā)揮著重要作用;在人類中，PPR蛋白還與各類神經(jīng)

2、衰退疾病相關(guān)。
　　PPR蛋白由2-30個(gè)數(shù)目不等的重復(fù)基序串聯(lián)而成，每個(gè)基序一般長35個(gè)氨基酸，這類基序稱為P型基序，研究表明PPR蛋白與靶標(biāo)RNA序列之間存在模塊化識(shí)別，即每個(gè)重復(fù)序列可以特異性地識(shí)別一個(gè)RNA堿基，基序中第5位和第35位的氨基酸在識(shí)別過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，這兩個(gè)位置氨基酸組合稱為識(shí)別密碼。PPR具有應(yīng)用于RNA操作的潛力，但是由于PPR基序特異性識(shí)別RNA堿基的分子機(jī)理尚不清楚，限制了PPR作為RNA操作工具的

3、開發(fā)進(jìn)程。為了揭示PPR基序與RNA堿基之間的識(shí)別機(jī)制，本研究的主要結(jié)果如下:
　　1、人工設(shè)計(jì)出一系列性質(zhì)均一且可溶的dPPR蛋白。
　　本課題組對(duì)擬南芥中所有P型PPR蛋白的基序進(jìn)行保守性分析，基序上第1-35位上均存在一個(gè)最保守的氨基酸，由這些保守氨基酸組成的序列稱為dPPR(designer PPR)基序。我們固定其他位置上的氨基酸不變，只改變第5位和第35位，于是得到攜帶不同識(shí)別密碼的dPPR基序。我們將10個(gè)dP

4、PR基序串聯(lián)并分別在N端和C端加上一段促進(jìn)水溶性的NTD和CTD結(jié)構(gòu)域，得到一系列人工設(shè)計(jì)的dPPR蛋白。實(shí)驗(yàn)證明，這些蛋白性質(zhì)均一穩(wěn)定，可溶性好。
　　2、揭示了PPR基序與RNA堿基之間互作的對(duì)應(yīng)關(guān)系
　　通過EMSA實(shí)驗(yàn)，我們篩選到可以分別特異識(shí)別四種RNA堿基的dPPR基序:當(dāng)dPPR基序的第5位和第35位分別為天冬酰胺N和天冬氨酸D時(shí)（簡稱ND），該dPPR基序特異識(shí)別RNA堿基U;當(dāng)dPPR基序的第5位和第35位

5、分別為天冬酰胺N和絲氨酸S時(shí)（簡稱NS），該dPPR基序特異識(shí)別RNA堿基C;當(dāng)dPPR基序的第5位和第35位分別為絲氨酸S和天冬酰胺N時(shí)(簡稱SN)，dPPR基序特異識(shí)別RNA堿基A;當(dāng)dPPR基序的第5位和第35位分別為蘇氨酸T和天冬氨酸D時(shí)（簡稱TD），該dPPR基序特異識(shí)別RNA堿基G。
　　3、解析了dPPR-RNA復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)，揭示dPPR基序與RNA堿基之間的識(shí)別機(jī)制。
　　為了揭示dPPR基序與RNA堿基

6、之間的識(shí)別機(jī)制，我們獲得了四種dPPR-RNA復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，其中dPPR蛋白分別識(shí)別四條含不同堿基的RNA系列。結(jié)構(gòu)顯示dPPR蛋白呈現(xiàn)右手超螺旋構(gòu)象將RNA包裹在內(nèi)部，在原子水平上揭示了識(shí)別密碼與對(duì)應(yīng)RNA堿基之間的特異識(shí)別模式。另外非密碼氨基酸如第2位的纈氨酸和第13位的賴氨酸分別通過范德華力和靜電力在RNA結(jié)合過程中發(fā)揮重要作用。
　　這一系列研究成果為準(zhǔn)確預(yù)測自然界中PPR蛋白的靶標(biāo)序列和研究新PPR蛋白的功能提供了參考，