白念珠菌性膿毒癥中HMGB1的表達(dá)及其作用的臨床和動物實驗研究.pdf

1、目的：侵襲性真菌感染已成為嚴(yán)重威脅人類健康的疾病，在細(xì)菌性膿毒癥中起著重要作用的晚期炎癥介質(zhì)---高遷移率族蛋白B1（high mobility group box1,HMGB1）是否也在侵襲性真菌感染中發(fā)揮著重要作用目前尚不清楚。而白念珠菌又是侵襲性真菌感染的主要病原體。本研究擬進(jìn)行白念珠菌性膿毒癥的臨床和動物實驗，研究HMGB1的表達(dá)情況，以期探討HMGB1在侵襲性白念珠菌感染中的作用，為侵襲性白念珠菌感染的防治提供新的治療靶點。<

2、br>　　方法：
　　1.臨床收集白念珠菌性膿毒癥患者的外周血，用ELISA和qRT-PCR檢測 HMGB1、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白介素-6（interleukin-6,IL-6）及HMGB1 mRNA的表達(dá)，并與臨床指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　2.構(gòu)建侵襲性白念珠菌感染動物模型，實驗分正常組、免疫抑制組、侵襲性白念珠菌感染組和侵襲性白念珠菌感染+丙酮酸乙酯（ethy

3、l pyruvate, EP）組，分別于感染后1、3、5和7d處死小鼠，取外周血檢測肝腎功和C-反應(yīng)蛋白（c-reactive protein,CRP）等指標(biāo)以明確小鼠的病情嚴(yán)重程度，取肺、肝和腎組織進(jìn)行HE染色觀察各組織損傷情況，ELISA檢測外周血HMGB1、TNF-α和IL-6的含量，qRT-PCR檢測小鼠外周血、肺、肝和腎組織中HMGB1 mRNA的表達(dá)，Western blot和免疫組化檢測肺、肝和腎組織中HMGB1的表達(dá)。<

4、br>　　結(jié)果：
　　1.白念珠菌性膿毒癥患者外周血qRT-PCR結(jié)果顯示，伴白念珠菌感染的嚴(yán)重膿毒癥患者、不伴真菌感染的嚴(yán)重膿毒癥患者和膿毒癥患者外周血HMGB1 mRNA的表達(dá)均高于正常人（P＜0.01），而伴白念珠菌感染和不伴真菌感染的嚴(yán)重膿毒癥患者又高于一般膿毒癥患者（P＜0.05或0.01）；但伴白念珠菌感染的嚴(yán)重膿毒癥患者和不伴真菌感染的嚴(yán)重膿毒癥患者外周血HMGB1 mRNA的表達(dá)沒有顯著性差異。
　　2.白念

5、珠菌性膿毒癥患者外周血ELISA結(jié)果顯示，伴白念珠菌感染的嚴(yán)重膿毒癥患者、不伴真菌感染的嚴(yán)重膿毒癥患者和膿毒癥患者血清中HMGB1、TNF-α和IL-6的表達(dá)均高于正常人；而伴白念珠菌感染和不伴真菌感染的嚴(yán)重膿毒癥患者又高于一般膿毒癥患者；且伴白念珠菌感染的嚴(yán)重膿毒癥患者血清中HMGB1和TNF-α的表達(dá)明顯高于不伴真菌感染的嚴(yán)重膿毒癥患者，但伴白念珠菌感染的嚴(yán)重膿毒癥患者和不伴真菌感染的嚴(yán)重膿毒癥患者血清中IL-6的表達(dá)沒有顯著性差異

6、。
　　3.Spearman相關(guān)分析顯示：白念珠菌性膿毒癥患者外周血HMGB1與降鈣素原（procalcitonin,PCT）、CRP和1,3-β-D-葡聚糖（1,3-β-D-glucan,BDG）成正相關(guān)（r分別為0.530、0.541、0.816，P＜0.05或0.01），與白細(xì)胞（white blood cell,WBC）無相關(guān)（r為0.093，P＞0.05）。
　　4.小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺后，血液中的白細(xì)胞、紅細(xì)胞、

7、血紅蛋白和血小板均明顯減少，其中以白細(xì)胞減少最為明顯，表明免疫抑制小鼠模型構(gòu)建成功。
　　5.根據(jù)不同濃度小鼠的生存曲線，本實驗選取的侵襲性白念珠菌感染的最適濃度為2×105個/ml。
　　6.肺、肝和腎組織培養(yǎng)及病理結(jié)果顯示：肺、肝和腎組織中均有白念珠菌生長，表明侵襲性白念珠菌感染模型構(gòu)建成功。
　　7.與正常組相比，免疫抑制組、侵襲性白念珠菌感染組和EP組小鼠在免疫抑制后第4d開始體重明顯下降（P＜0.05）；與免

8、疫抑制組相比，侵襲性白念珠菌感染組和EP組小鼠在感染后第2d開始體重明顯下降（P＜0.05）；與EP組相比，侵襲性白念珠菌感染組小鼠在感染后第3d開始體重明顯下降（P＜0.05）。
　　8.侵襲性白念珠菌感染組小鼠的死亡率為33.33％，EP組小鼠的死亡率為13.33%；與侵襲性白念珠菌感染組相比，EP能顯著減少小鼠的死亡率，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　9.生化和病理結(jié)果顯示，與正常組和免疫抑制組相比，侵襲性白念

9、珠菌感染組小鼠的肺、肝和腎組織明顯受損，CRP明顯升高；而與侵襲性白念珠菌感染組相比，EP組小鼠肺、肝和腎組織受損程度明顯減輕，CRP明顯降低。
　　10.外周血、肺、肝和腎組織qRT-PCR結(jié)果顯示，與正常組和免疫抑制組相比，侵襲性白念珠菌感染組和EP組小鼠的外周血、肺、肝和腎組織中HMGB1 mRNA的表達(dá)均明顯增加（P＜0.05或0.01）；而與侵襲性白念珠菌感染組相比， EP組小鼠在感染后3d開始HMGB1 mRNA的表達(dá)

10、明顯減少（P＜0.01）。
　　11.肺、肝和腎組織Western blot結(jié)果顯示：白念珠菌感染后，侵襲性白念珠菌感染組和EP組小鼠肺、肝和腎組織中HMGB1的表達(dá)明顯增加；與侵襲性白念珠菌感染組相比，EP能顯著抑制HMGB1的表達(dá)。
　　12.肺、肝和腎組織免疫組化結(jié)果顯示，白念珠菌感染后，侵襲性白念珠菌感染組小鼠肺組織HMGB1的表達(dá)明顯增加，主要集中在細(xì)胞核內(nèi)；肝組織細(xì)胞核內(nèi)HMGB1的表達(dá)明顯增加，同時隨著感染天數(shù)

11、的延長，肝細(xì)胞胞漿中HMGB1的表達(dá)也明顯增高；腎組織皮質(zhì)中胞核和胞漿中HMGB1的表達(dá)均明顯增加。而與侵襲性白念珠菌感染組相比， EP不僅能明顯抑制胞核中HMGB1的表達(dá)，也能明顯抑制HMGB1從胞核釋放到胞漿中。
　　13.外周血ELISA結(jié)果顯示，侵襲性白念珠菌感染組和EP組小鼠外周血HMGB1、TNF-α和IL-6的表達(dá)明顯增高（P＜0.01）；與侵襲性白念珠菌感染組相比，EP組小鼠外周血HMGB1、TNF-α和IL-6的

12、表達(dá)明顯降低（P＜0.05或0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.白念珠菌性膿毒癥患者外周血HMGB1蛋白水平明顯高于不伴真菌感染的嚴(yán)重膿毒癥患者，但兩者外周血HMGB1 mRNA的表達(dá)沒有顯著性差異。目前HMGB1在白念珠菌性膿毒癥中的研究還未見報道，本實驗收集到的樣本量少，HMGB1在白念珠菌性膿毒癥中的作用還需進(jìn)一步研究。
　　2.白念珠菌性膿毒癥患者外周血HMGB1與PCT、CRP和BDG成正相關(guān)。根據(jù)其他細(xì)菌膿毒

13、癥和本實驗研究結(jié)果，我們猜測HMGB1結(jié)合臨床上不同的指標(biāo)，有助于區(qū)別細(xì)菌膿毒癥和真菌膿毒癥的診斷。但本實驗收集到的樣本量少，這一猜想還有待進(jìn)一步證明。
　　3.本實驗構(gòu)建侵襲性白念珠菌感染動物模型選取的最適感染濃度為2×105個/ml，組織培養(yǎng)和組織病理學(xué)方法均證實侵襲性白念珠菌感染動物模型構(gòu)建成功。
　　4.侵襲性白念珠菌感染組小鼠外周血、肺、肝和腎組織中HMGB1 mRNA和蛋白表達(dá)明顯增高，而與侵襲性白念珠菌感染組相