幽門螺桿菌對小鼠淋巴細胞及胃黏膜Tim-3的影響及其與Th免疫反應的關系.pdf

1、目的：機體的免疫反應在幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，H.pylori)致病中起重要作用，闡明H.pylori感染的免疫致病機制對于H.pylori相關性疾病的防治具有十分重要的意義。輔助性T細胞(T helper，Th)免疫反應在H.pylori感染的免疫致病中起重要作用。但是H.pylori感染究竟通過何種機制影響Th反應，目前尚不清楚。T細胞免疫球蛋白黏蛋白結構域相關分子(T-cell immunoglobul

2、in andmucin-domain-containing molecule，Tim)是新近發(fā)現(xiàn)在T細胞表面的跨膜蛋白家族，它在CD4+T細胞分化成Th1和Th2細胞，及調控效應T細胞的免疫反應中起重要作用。Tim-3是Tim家族中的重要成員，它表達在分化成熟的Th1細胞表面，調節(jié)不同Th細胞亞群的功能，并影響調節(jié)性T細胞(Regulatory T cell，Treg)和Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)信號

3、通路。H.pylori感染對Tim-3的影響目前尚不清楚。為此本研究在體內(nèi)外觀察了H.pylori感染后Tim-3的表達，及其與Th1和Th2免疫反應的關系，旨在初步探討H.pylori感染影響Th反應的機制，為后續(xù)以Tim-3為靶點防治H.pylori感染和H.pylori相關性疾病提供理論和實驗依據(jù)。
　　 方法：⑴H.pylori活菌與小鼠脾淋巴細胞共培養(yǎng)：以不同濃度的悉尼1號(SydneyStrain1，SS1)H.py

4、lori活菌與原代分離的BALB/c小鼠脾淋巴細胞共培養(yǎng)12h，細菌與細胞數(shù)之比分別為0 CFU：1(對照組)、100 CFU：1(實驗組A)、400 CFU：1(實驗組B)和700 CFU：1(實驗組C)。⑵小鼠H.pylori感染模型建立：10只6-8周齡的清潔級的BALB/c小鼠，給予含1.0×109/ml的SS1 H.pylori活菌液，0.5ml/只，灌胃，隔日一次，共5次。末次灌胃后12周后處死小鼠，取胃黏膜進行H.pylo

5、ri和病理學檢測，確定模型建立后，取標本待測。另取10只小鼠不給予H.pylori，作為正常對照組。⑶各項指標檢測：①胃黏膜內(nèi)H.pylori的檢測：采用改良Giemsa染色和H.pylori培養(yǎng)；②H.pylori作用小鼠淋巴細胞上清和胃黏膜內(nèi)IL-2、IL-4、IL-10、IL-12、IFN-γ含量的檢測：采用雙抗體夾心ELISA法；③胃粘膜及淋巴細胞內(nèi)Tim-3、Foxp3、MyD88蛋白的檢測：采用Western blot。

6、r>　　 結果：①H.pylori活菌作用小鼠淋巴細胞12h后顯著上調小鼠淋巴細胞內(nèi)Tim-3、MyD88蛋白表達(P<0.005)，各實驗組Tim-3蛋白表達顯著高于對照組(P<0.005)。實驗組B和C MyD88蛋白表達顯著高于對照組(P<0.05)；實驗組A MyD88蛋白表達與對照組無顯著差異(P>0.05)。Foxp3蛋白表達在各實驗組和對照組無顯著差異(P>0.05)。②H.pylori活菌作用小鼠淋巴細胞12h后對IL

7、-4、IL-10、IL-12、IFN-γ含量均有顯著影響(P<0.001，0.05)，各實驗組培養(yǎng)上清中IL-4和IL-10含量均顯著低于對照組，并隨著H.pylori活菌數(shù)增加，IL-4和IL-10含量逐漸降低(P<0.001，0.005，0.05)；各實驗組培養(yǎng)上清中IL-12和IFN-γ含量均顯著高于對照組(P<0.005，0.05)，且實驗組B和C顯著高于實驗組A(P<0.001)；各實驗組和對照組培養(yǎng)上清中IL-2含量無顯著差

8、異(P>0.05)。③H.pylori感染小鼠胃粘膜內(nèi)Tim-3、MyD88和Foxp3蛋白表達均顯著高于正常對照組(P<0.01，0.05)。④胃黏膜內(nèi)IL-4、IL-10、IL-12和IFN-γ含量在對照組和H.pylori感染組之間均有顯著差異(P<0.01，0.05)，Th1細胞因子IL-12和IFN-γ含量在H.pylori感染組均顯著高于正常對照組(P<0.005，0.05)，Th2細胞因子IL-4和IL-10含量在H.py

9、lori感染組均顯著低于正常對照組(P<0.01，0.05)。⑤在H.pylori感染組，小鼠胃粘膜內(nèi)Tim-3蛋白的表達與胃黏膜內(nèi)Th2細胞因子IL-4和IL-10含量呈顯著負相關(Rs=-0.922和-0.954，P<0.05)，與Th1細胞因子IFN-γ和IL-12含量呈顯著正相關(Rs=0.902和0.933，P<0.05)；在正常對照組Tim-3蛋白的表達與胃黏膜內(nèi)IL-4、IL-10、IFN-γ和IL-12含量無顯著相關性(

10、R=-0.727，-0.531，0.746和0.630，P>0.05)。⑥在H.pylori感染組，小鼠胃粘膜內(nèi)Tim-3蛋白表達與MyD88蛋白表達呈顯著正相關(Rs=0.905，P<0.05)，與Foxp3蛋白表達無顯著相關(Rs=0.723，P>0.05)；在正常對照組Tim-3蛋白表達與MyD88和Foxp3蛋白表達無顯著相關性(Rs=0.819和0.508，P>0.05)。
　　 結論：⑴H.pylori在體內(nèi)外均可上

11、調Tim-3的表達，促進Th1細胞分泌IL-12、IFN-γ等細胞因子，抑制Th2細胞分泌IL-4、IL-10細胞因子，提示它可抑制T淋巴細胞向Th2細胞分化，促進T淋巴細胞向Th1細胞分化，誘導Th1優(yōu)勢的免疫反應。⑵H.pylori感染小鼠胃黏膜內(nèi)Tim-3表達與Th1細胞因子含量呈正相關，與Th2細胞因子含量呈負相關，說明H.pylori感染時Tim-3表達能較好的反映Th免疫反應；同時也與胃黏膜內(nèi)TLRs信號通路中的關鍵分子My