豬AMSCs成脂分化過程中KLF15和KLF2的表達模式及姜黃素的調控作用.pdf

1、本研究旨在探討豬AMSCs成脂分化過程中KLF15和KLF2的表達模式及姜黃素對其表達模式的調控作用。研究采用1月齡健康仔豬，用外科手術方法采集頸背部脂肪組織，膠原酶消化過濾后，通過原代和傳代培養(yǎng)分離純化了脂肪干細胞。用3代以上的脂肪干細胞進行成脂誘導分化，用油紅O染色提取法進行了成脂分化程度的定量分析，用PCR檢測法進行了KLF15和KLF2表達的定性分析，用熒光定量PCR檢測法進行了KLF15和KLF2表達的定量分析，用不同濃度姜黃

2、素處理，檢測了姜黃素對成脂分化率及KLF15和KLF2表達模式的影響。通過上述研究，獲得如下結果：
　　1.豬AMSCs的分離培養(yǎng)和誘導分化
　　用分離獲得的 F3代 AMSCs進行成脂誘導分化（誘導液：100nmol/l羅格列酮+0.05mmol/l3-異丁基-1-甲基黃嘌呤+100nmol/l胰島素+100nmol/l地塞米松），油紅O提取法檢測AMSCs成脂分化率。結果顯示，在誘導2d后，少量細胞開始分化，分化細胞內可

3、見串珠狀小脂滴。隨著延長誘導時間，脂滴變大，數(shù)量增多；誘導9d后可見大脂滴，周圍充滿小脂滴；誘導15d時，成脂分化率可達到60％左右，表明本研究采用的誘導方法可行。
　　2.豬AMSCs誘導分化過程中 KLF15和KLF2的表達模式
　　為檢測KLF15的表達模式，將AMSCs在誘導環(huán)境中分別誘導分化2d、4d、8d、10d、12d和16d；為檢測KLF2的表達模式，將AMSCs在誘導環(huán)境中分別誘導分化6h、12h、24h、

4、30h和42h。收集不同時間誘導分化的細胞，提取總RNA，用熒光定量PCR分別檢測 KLF15和KLF2 mRNA的表達。結果顯示，KLF15表達以2d表達量為對照，其它各天表達分別為2d的1.03±0.007、1.66±0.005、2.15±0.006、2.47±0.006和2.75±0.004倍；KLF2表達以6h表達量為對照，其它各小時表達倍數(shù)量分別為0.84±0.007、0.72±0.08、0.70±0.002和0.65±0.0

5、06。這些結果表明KLF15隨誘導時間的增加，表達量逐步增加，說明KLF15促進脂肪細胞的分化，在脂肪分化過程中起著重要作用；KLF2的表達量在成脂誘導分化6h時已達到高峰，之后隨誘導時間的延長逐步下降，表明 KLF2在誘導分化早期，為維持前脂肪細胞階段發(fā)揮重要作用。
　　3.姜黃素對豬AMSCs成脂分化的影響
　　取匯合度達90%的F3代細胞，分別加入含1、5、10、15、20和25μmol/l的姜黃素的成脂誘導液作用24

6、h，然后在誘導液中誘導分化3d，之后換成維持液維持2d；如此循環(huán)誘導至10d，油紅O染色觀察成脂分化率。結果顯示，1~25μmol/l姜黃素均能顯著抑制（P＜0.05）細胞的分化，其抑制率分別為7.98%、14.55%、26.92%、39.75%、62.44%、65.26%，25μmol/l姜黃素抑制率最高，表明姜黃素能夠有效抑制成脂分化。
　　4.姜黃素對豬AMSCs成脂分化過程中KLF15表達模式的影響
　　取F3代細胞

7、，用含25μmol/l姜黃素的成脂誘導液作用24h，然后置換成脂誘導液，分別誘導4d、8d、10d、12d和16d，提取總RNA，用Real-time PCR檢測姜黃素對KLF15 mRNA表達的影響。結果顯示，25μmol/l姜黃素抑制KLF15 mRNA表達率分別達到47.3%、62.6%、60.2%、41.6%和33.1%，可以看出姜黃素抑制KLF15 mRNA的表達能力在誘導分化中期最高，表明姜黃素抑制KLF15 mRNA的表達