干細(xì)胞因子SALL4在MDS發(fā)生發(fā)展和預(yù)后判斷中的臨床應(yīng)用及機(jī)制研究.pdf

1、骨髓增生異常綜合征(Myelodysplastic syndromes，MDS)是一種造血干細(xì)胞克隆性疾病，其主要特點(diǎn)為骨髓無(wú)效造血導(dǎo)致外周血細(xì)胞減少，以及造血干細(xì)胞基因組不穩(wěn)定導(dǎo)致向急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)高轉(zhuǎn)化的危險(xiǎn)。由于MDS分型復(fù)雜，不同類型的MDS具有不同的病態(tài)造血表現(xiàn)，這給MDS的診斷、治療和預(yù)后監(jiān)測(cè)帶來(lái)了很大困惑。
　　SALL4是果蠅婆羅雙樹(shù)基因(Drosophila

2、spalt)的同源基因，定位于第20號(hào)染色體的q13.13～q13.2。近來(lái)研究表明，SALL4在維持胚胎干細(xì)胞的多能性方面起著重要作用，并與造血發(fā)育和血液惡性腫瘤的發(fā)生具有相關(guān)性。SALL4B過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)生了MDS類似征候群，進(jìn)而轉(zhuǎn)化為白血病。然而SALL4在MDS各亞型中的具體表達(dá)模式及臨床應(yīng)用價(jià)值目前國(guó)內(nèi)外尚沒(méi)有報(bào)道。本研究中我們一方面從基因和蛋白兩個(gè)水平分析SALL4在MDS不同亞型和分期中的表達(dá)模式，同時(shí)對(duì)MDS患者進(jìn)

3、行長(zhǎng)期隨訪評(píng)價(jià)SALL4在MDS預(yù)后判斷中的臨床價(jià)值;另一方面采用SALL4B轉(zhuǎn)基因小鼠模型和SALL4條件性基因敲除模型從基因功能獲得和缺失兩個(gè)角度深入探討SALL4在MDS及AML發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。
　　材料和方法:
　　本研究主要分為三個(gè)部分，第一部分中我們對(duì)2009年12月至2011年12月間就診于北京協(xié)和醫(yī)院、北京西苑醫(yī)院、北京醫(yī)院及北京市道培醫(yī)院的部分MDS患者，其中新發(fā)MDS55例，已進(jìn)展為AML的MDS2

4、0例，經(jīng)治療后好轉(zhuǎn)的MDS16例以及10例健康骨髓供者的骨髓及外周血標(biāo)本提取RNA和蛋白質(zhì)，分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)及Western blot技術(shù)分析SALL4在MDS患者不同WHO分型及國(guó)際預(yù)后評(píng)分系統(tǒng)(InternationalPrognostic Scoring System，IPSS)預(yù)后分期中的表達(dá)水平，同時(shí)對(duì)55例新發(fā)MDS患者進(jìn)行長(zhǎng)達(dá)兩年的隨訪，評(píng)估SALL4在MDS預(yù)后判斷中的臨床價(jià)值。
　　第二部分中我們采

5、用SALL4B轉(zhuǎn)基因小鼠模型，通過(guò)同源重組(Homologous recombination，HR)和非同源重組性末端連接(Non-homologous end joining，NHEJ)報(bào)告質(zhì)粒研究SALL4在DNA損傷修復(fù)及染色體穩(wěn)定性方面的作用，進(jìn)一步探討SALL4在MDS發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。
　　第三部分中我們采用SALL4條件性基因敲除小鼠模型，通過(guò)骨髓移植及集落培養(yǎng)傳代技術(shù)，從體內(nèi)試驗(yàn)和體外試驗(yàn)兩個(gè)方面研究SALL4

6、在Hoxa9/Meis1白血病系統(tǒng)中的作用。
　　結(jié)果:
　　第一部分研究發(fā)現(xiàn)，SALL4高表達(dá)于部分治療前MDS患者骨髓及外周血細(xì)胞中，并且在MDS向AML轉(zhuǎn)化的患者中表達(dá)增高，在治療后MDS患者中表達(dá)降低。而在不同類型的MDS患者中，SALL4高表達(dá)主要見(jiàn)于難治性貧血伴原始細(xì)胞增多1型(Refractory anemia with excess blasts-1，RAEB-1)和2型(RAEB-2)及IPSS中危二期及高

7、危期，這種表達(dá)模式與Bmi-1的表達(dá)模式相類似。我們還發(fā)現(xiàn)SALL4表達(dá)水平與MDS部分臨床參數(shù)如骨髓原始細(xì)胞百分比、染色體核型、IPSS分值等之間具有良好相關(guān)性。我們對(duì)本研究中的MDS患者進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)兩年的隨訪，結(jié)果表明SALL4表達(dá)水平較高的患者臨床預(yù)后較差，提示SALL4在MDS患者的預(yù)后判斷中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　第二部分對(duì)SALL4B轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，SALL4在MDS中具有抑制DNA損傷修復(fù)和抑制凋亡的雙重作用

8、，在SALL4高表達(dá)的MDS骨髓細(xì)胞中，當(dāng)DNA受到損傷時(shí)，一方面由于SALL4升高引起FANCL介導(dǎo)的HR DNA修復(fù)程序受損而使損傷不能得到完全修復(fù)，另一方面由于SALL4升高引起B(yǎng)CL2介導(dǎo)的抑制凋亡使受損細(xì)胞不能凋亡，從而使帶有DNA損傷的細(xì)胞得以存活下來(lái)，隨著其他損傷及突變的累積最終導(dǎo)致白血病的發(fā)生。
　　第三部分對(duì)SALL4條件性基因敲除小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，該SALL4條件性基因敲除小鼠在正常造血發(fā)育過(guò)程中與野生型小鼠相

9、比，在Hoxa9/Meis1白血病模型中，SALL4條件性基因敲除小鼠骨髓細(xì)胞雖然能在Hoxa9/Meis1作用下進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并在第一次移植后的受體小鼠內(nèi)誘發(fā)白血病，但在第二次移植后，其致白血病能力明顯喪失，提示SALL4在維持白血病發(fā)展方面具有作用，這為SALL4升高的MDS及白血病的靶向治療提供了新的契機(jī)。
　　結(jié)論:
　　我們首次報(bào)道了干細(xì)胞因子SALL4在MDS不同WHO亞型及IPSS分期中的表達(dá)水平，提出SALL4在

10、MDS的預(yù)后判斷中具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　我們首次報(bào)道了干細(xì)胞因子SALL4在MDS中具有抑制DNA損傷修復(fù)和抑制受損細(xì)胞凋亡的雙重作用，并通過(guò)HR和NHEJ報(bào)告質(zhì)粒證實(shí)SALL4過(guò)表達(dá)主要抑制HR修復(fù)通路。
　　本研究首次采用SALL4條件性基因敲除小鼠從從基因功能缺失方面研究SALL4在白血病發(fā)生發(fā)展中的必要性，SALL4條件性基因敲除小鼠骨髓細(xì)胞雖能經(jīng)HOXA9/Meis1轉(zhuǎn)化并在第一次移植后誘導(dǎo)白血病，但最終由