基于IgY哈氏弧菌快速檢測(cè)方法建立及其被動(dòng)免疫保護(hù)研究.pdf

1、目的：
　　 本文主要研究了以水產(chǎn)致病性哈氏弧菌為抗原，免疫SPF蛋雞，制備特異性卵黃抗體，從抗體的提取、純化等方面進(jìn)行了進(jìn)一步的優(yōu)化研究；建立基于IgY的快速、準(zhǔn)確、定量的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)抗原菌濃度的技術(shù)；同時(shí)開展抗哈氏弧菌卵黃抗體對(duì)黑鯛被動(dòng)免疫的研究。本研究在一定程度上緩解了魚類疾病的防治中抗生素帶來的種種弊端，為魚病病原的快速檢測(cè)提供理論基礎(chǔ)，為特異性IgY被動(dòng)免疫保護(hù)機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。
　　 方

2、法：
　　 1．采用飽和硫酸銨沉淀法和葡聚糖凝膠SephadexG-75凝膠柱層析，分離和純化特異性卵黃抗體，然后采用SDS-PAGE分析純化蛋白的部分特性，將其作為建立間接ELISA檢測(cè)抗原的一抗。
　　 2．建立基于IgY的間接ELISA測(cè)定抗原濃度的技術(shù)方法，確定抗原包被濃度、一抗IgY和酶標(biāo)二抗最適稀釋倍數(shù)，抗原包被條件的選擇，底物的最佳反應(yīng)時(shí)間等間接ELISA的實(shí)驗(yàn)條件。
　　 3．在黑鯛感染哈氏弧菌前

3、或后通過口服或注射抗哈氏弧菌特異性IgY，用間接ELISA法對(duì)黑鯛血清及脾、肝、腎、腸、鰓、肌肉中IgY水平進(jìn)行檢測(cè)，分析IgY在黑鯛體內(nèi)的吸收規(guī)律。
　　 結(jié)果：
　　 1．通過硫酸銨沉淀法和SephadexG-75凝膠柱層析方法分離，獲得純度較高的免疫球蛋白，經(jīng)β-巰基乙醇處理后解離形成重鏈和輕鏈兩個(gè)亞單位，分子量分別為67kD、23kD。
　　 2．建立了基于IgY的間接ELISA測(cè)定哈氏弧菌的方法，試驗(yàn)的

4、最佳反應(yīng)條件為：抗原最適工作濃度濃度為1×108cfu/mL，包被4℃過夜；一抗IgY稀釋度分別為1∶28;購(gòu)買的兔抗雞IgY-HRP酶標(biāo)抗體作1∶20000稀釋；選擇底物的最佳反應(yīng)時(shí)間為20min。
　　 3．注射和口服抗哈氏弧菌特異性IgY對(duì)黑鯛能產(chǎn)生較好的免疫保護(hù)效果。其中連續(xù)口服組6d組在血液，肝、腎、腸中存在較高的抗體，可以持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間的免疫，為最佳預(yù)防免疫途徑，早期感染治療使用口服方式比較好。
　　 結(jié)論：<

5、br>　　 1、成功純化出抗哈氏弧菌特異性IgY，重鏈和輕鏈的分子量分別為67kD、23kD;
　　 2、建立了基于IgY檢測(cè)哈氏弧菌的間接ELISA檢測(cè)技術(shù)，最佳反應(yīng)條件為：抗原最適工作濃度濃度為1×108cfu/mL，包被4℃過夜；檢測(cè)血清稀釋度分別為1:28;購(gòu)買的兔抗雞IgY-HRP酶標(biāo)抗體作1:20000稀釋；選擇底物的最佳反應(yīng)時(shí)間為20min。
　　 3、抗哈氏弧菌特異性IgY能顯著增強(qiáng)黑鯛對(duì)哈氏弧菌感染的