環(huán)氧事酶-2抑制劑對(duì)腦外傷小鼠海馬TNF-α與IL-1β表達(dá)的影響.pdf

1、目的:
　　 腦外傷的病理生理機(jī)制復(fù)雜，炎癥反應(yīng)是腦外傷后繼發(fā)性腦損傷的重要組成部分。腦外傷后，炎癥反應(yīng)加劇，IL-1β、TNF-α和IL-6等炎性因子生成增加，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而進(jìn)一步加重外傷性腦損傷，影響預(yù)后。因此，抑制炎癥因子生成可對(duì)腦外傷起到一定程度的保護(hù)作用。
　　 環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是花生四烯酸(arachidonic acid，AA)代謝、前列腺素(prosta

2、glandin，PG)和血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)生物合成過程中重要的限速酶，是誘導(dǎo)性酶，在正常生理狀態(tài)下幾乎不表達(dá)或甚少表達(dá)，主要表達(dá)于炎癥細(xì)胞，特別是巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和滑膜細(xì)胞，是對(duì)組織缺氧和損傷的反應(yīng)。近期許多研究表明，腦外傷早期伴隨炎癥反應(yīng)的發(fā)生，腦組織中COX-2的表達(dá)常異常增高，且這種增高狀態(tài)持續(xù)越久，預(yù)后越不良，COX-2的大量生成可能是導(dǎo)致患者損傷加劇的重要因素之一，通過抑制COX-2的產(chǎn)生可

3、以為治療腦創(chuàng)傷早期炎癥反應(yīng)提供新途徑，因此，COX-2在腦外傷的病理機(jī)制的研究已經(jīng)成為近階段的研究熱點(diǎn)。
　　 腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)是體內(nèi)的一個(gè)重要炎性因子，由單核-巨噬細(xì)胞分泌，能促進(jìn)中性粒細(xì)胞吞噬，殺傷和抑制腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化，激發(fā)細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，繼而造成細(xì)胞因子的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而誘生其他的炎性介質(zhì)從不同的環(huán)節(jié)參與炎性反應(yīng)，引起器官組織損傷，是炎癥反應(yīng)的一個(gè)重要

4、啟動(dòng)因子。腦外傷后，TNF-α生成增加，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而進(jìn)一步加重外傷性腦損傷。但是TNF-α是否參與了COX-2調(diào)節(jié)的腦外傷病理機(jī)制，是一個(gè)值得探討的問題。
　　 白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）是一種具有多種生物學(xué)功能的炎性細(xì)胞因子，可引起白細(xì)胞的聚集并可刺激白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等表達(dá)細(xì)胞間粘附分子，介導(dǎo)中性粒細(xì)胞的浸潤，進(jìn)而加重?fù)p傷區(qū)的炎癥反應(yīng);可誘導(dǎo)TNF-α、IL-6等炎性細(xì)胞因子的釋放，增加NO的合成和釋放。腦外傷后

5、，IL-1β生成增加，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而進(jìn)一步加重外傷性腦損傷。這都提示著IL-1β在腦外傷發(fā)病中有著重要作用，但是IL-1β是否參與了COX-2調(diào)節(jié)的腦外傷病理機(jī)制尚不十分清楚。
　　 本研究通過自由落體法復(fù)制閉合性腦外傷小鼠模型，利用免疫組織化學(xué)方法和Western blot方法檢測腦外傷組、吲哚美辛治療組和正常組小鼠海馬TNF-α和IL-1β的表達(dá)量的變化，探討吲哚美辛能否通過調(diào)節(jié)炎性因子TNF-α和IL-1β參與腦外

6、傷的病理機(jī)制的調(diào)節(jié)。通過這些問題的解決，我們將進(jìn)一步清楚COX-2參與腦外傷的病理機(jī)制，為尋找新的腦外傷治療方法提供理論依據(jù)。
　　 材料和方法:
　　 一、實(shí)驗(yàn)材料
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本研究采用雄性BALB/c小鼠90只，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重在18-25g。
　　 2、主要試劑兔抗小鼠IL-1β抗體，兔抗小鼠TNF-α抗體均購于Sigma公司;辣根過氧化物酶結(jié)合羊抗兔免疫球蛋白和SP法免

7、疫組化試劑盒均購于武漢博士德試劑公司;β-actin，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二次抗體均購于北京中杉公司。
　　 3、主要儀器電熱恒溫干燥箱;電子分析天平;恒溫水浴箱;低溫冷凍離心機(jī);紫外分光光度計(jì);通用電泳儀;轉(zhuǎn)印儀;-80度深低溫冰箱;恒溫冰凍切片機(jī);Motic Images Advanced3.2圖象分析系統(tǒng);
　　 二、實(shí)驗(yàn)方法
　　 1、制備小鼠腦外傷模型.采用改良的自由落體法復(fù)制閉合性腦外傷小鼠模

8、型。
　　 2、免疫組織化學(xué)檢測各組小鼠海馬TNF-α和IL-1β的表達(dá)。
　　 3、Western blot方法檢測各組小鼠海馬TNF-α和IL-1β的表達(dá)。
　　 4、圖象分析
　　 Western blot結(jié)果用Chemi Imager5500V2.03軟件掃描，用Fluor Chen2.0軟件定量分析顯色帶的MOD值。免疫組化結(jié)果用Motic Images Advanced3.2實(shí)時(shí)圖象分析系統(tǒng)采

9、集照片并進(jìn)行定量分析。
　　 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
　　 所有數(shù)值均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，組間比較進(jìn)行t檢驗(yàn)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 一、TNF-α
　　 免疫組化方法檢測小鼠海馬TNF-α蛋白表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組小鼠海馬TNF-α蛋白僅有少量的表達(dá)，腦損傷6h小鼠海馬TNF-α蛋白表達(dá)顯著升高，12h表達(dá)量最高，3d時(shí)略有下降，7d時(shí)仍顯著高于假手術(shù)組，P

10、＜0.05;而與相同時(shí)間點(diǎn)腦外傷組相比，吲哚美辛治療組的小鼠海馬TNF-α蛋白表達(dá)的光密度值顯著降低，P＜0.05。
　　 Western blot結(jié)果分析各組小鼠海馬TNF-α蛋白的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組小鼠海馬TNF-α蛋白表達(dá)與內(nèi)參照β-actin的光密度比值相比較，6h時(shí)間點(diǎn)腦外傷組小鼠海馬TNF-α蛋白表達(dá)與β-actin的光密度比值顯著升高，12h表達(dá)量最高，3d時(shí)略有下降，7d時(shí)仍顯著高于假手術(shù)組，P＜0.05;而

11、與相同時(shí)間點(diǎn)腦外傷組相比，吲哚美辛治療組的小鼠海馬TNF-α蛋白表達(dá)的光密度值顯著降低，P＜0.05。
　　 二、IL-1β
　　 免疫組化方法檢測小鼠海馬IL-1β蛋白表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組小鼠海馬IL-1β蛋白僅有少量的表達(dá)，腦損傷6h小鼠海馬IL-1β蛋白表達(dá)顯著升高，3d時(shí)表達(dá)量最高，7d時(shí)仍顯著高于假手術(shù)組，P＜0.05;而與相同時(shí)間點(diǎn)腦外傷組相比，吲哚美辛治療組的小鼠海馬IL-1β蛋白表達(dá)的光密度值顯著降低，P

12、＜0.05。
　　 Western blot結(jié)果分析各組小鼠海馬IL-1β蛋白的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組小鼠海馬IL-1β蛋白表達(dá)與內(nèi)參照β-actin的光密度比值相比較，6h時(shí)間點(diǎn)腦外傷組小鼠海馬IL-1β蛋白表達(dá)與β-actin的光密度比值顯著升高，3d時(shí)表達(dá)量最高，7d時(shí)仍顯著高于假手術(shù)組，P＜0.05;而與相同時(shí)間點(diǎn)腦外傷組相比，吲哚美辛治療組的小鼠海馬IL-1β蛋白表達(dá)的光密度值顯著降低，P＜0.05。
　　 討

13、論:
　　 在本實(shí)驗(yàn)的研究中發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組小鼠海馬炎性因子TNF-α蛋白僅有少量的表達(dá)，而在腦損傷后表達(dá)迅速增加，腦損傷后6h時(shí)，腦損傷組小鼠海馬TNF-α蛋白表達(dá)已顯著升高，12h時(shí)，TNF-α蛋白達(dá)到峰值，3d時(shí)略有下降，到7d時(shí)仍顯著高于假手術(shù)組，P＜0.05;而在經(jīng)腹腔注射吲哚美辛后的6h，腦損傷小鼠海馬的TNF-α蛋白的表達(dá)開始降低，與腦損傷組相比差異顯著，P＜0.05，結(jié)果提示降低TNF-α蛋白的表達(dá)，很可能是吲哚美

14、辛降低腦外傷早期炎癥反應(yīng)的機(jī)制之一。而與相同時(shí)間點(diǎn)的24h、3d和7d腦外傷組相比較，吲哚美辛治療組的小鼠海馬TNF-α蛋白表達(dá)的光密度值依然顯著降低，結(jié)果提示，吲哚美辛對(duì)于腦外傷后7d時(shí)的炎癥反應(yīng)依然發(fā)揮著作用。
　　 本實(shí)驗(yàn)研究還發(fā)現(xiàn)，假手術(shù)組小鼠海馬炎性因子IL-1β蛋白僅有少量的表達(dá)，而在腦損傷后表達(dá)迅速增加，腦損傷后6h時(shí)，腦損傷組小鼠海馬IL-1β蛋白表達(dá)已顯著升高，3d時(shí)， IL-1β蛋白達(dá)到峰值，到7d時(shí)仍顯著高

15、于假手術(shù)組，P＜0.05;而在經(jīng)腹腔注射吲哚美辛后的6h，腦損傷小鼠海馬的IL-1β蛋白的表達(dá)開始降低，與腦損傷組相比差異顯著，P＜0.05，結(jié)果提示降低IL-1β蛋白的表達(dá)，很可能是吲哚美辛降低腦外傷早期炎癥反應(yīng)的機(jī)制之一。而與其他相同時(shí)間點(diǎn)的腦外傷組相比較，吲哚美辛治療組的小鼠海馬IL-1β蛋白表達(dá)的光密度值依然顯著降低，結(jié)果提示，吲哚美辛對(duì)于腦外傷后7d時(shí)的炎癥反應(yīng)依然發(fā)揮著作用。
　　 本研究進(jìn)一步明確了COX-2參與腦