三色革裥菌Lenzetis tricolor胞外漆酶純化及性質(zhì)研究.pdf

1、通過正交實(shí)驗(yàn)研究了碳源、氮源、木素類似物以及初始pH值對三色革裥菌Lenzetistricolor產(chǎn)胞外漆酶的影響，并經(jīng)不同碳源及氮源濃度的驗(yàn)證，得到最佳培養(yǎng)基為(g/L)：淀粉20，牛肉蛋白胨2.0，Na2HPO4·12H2O0.47，KH2PO40.45，MgSO4·7H2O0.5，CaCl20.01，MnSO4·4H2O0.001，F(xiàn)eSO4·7H2O0.001，ZnSO4·7H2O0.001，CuSO4·5H2O0.001，愈創(chuàng)

2、木酚0.062及VB150μg，高壓滅菌后pH約5.0。在此基礎(chǔ)上檢測了不同培養(yǎng)方式下漆酶活性、菌絲干重、殘?zhí)橇考皃H值變化情況，確定最佳培養(yǎng)方式為母液和發(fā)酵液均為靜置培養(yǎng)。 對該菌產(chǎn)漆酶的粗酶采取兩種方法純化：方法一，(NH4)2SO4鹽析、透析、聚乙二醇濃縮上SephadexG-150凝膠柱(1.6×60)、收集有漆酶活性部分聚乙二醇濃縮上EDAE-SephadexA25離子交換層析柱(2.6×40)；方法二，(NH4)2S

3、O4鹽析、透析、超濾濃縮、上DEAE-SepharoseFF離子交換凝膠柱(1.6×50)、收集有漆酶活性部分聚乙二醇濃縮上SephadexG-75凝膠柱(1.6×50)。第一種純化方法最終純化倍數(shù)達(dá)9.36，活力回收率為8.6％。分析SephadexG-150層析過程中280nm吸收值、活力變化二者的關(guān)系表明，分離本菌種產(chǎn)漆酶選用SephadexG-150分子篩介質(zhì)分離范圍過大。第二種純化方法最終純化倍數(shù)達(dá)18.54，活力回收率為37

4、.17％。從EDAE-SepharoseFF離子交換層析及SephadexG-75分子篩層析過程中活力值與280nm吸收值曲線重疊情況看，分離此漆酶選擇EDAE-SepharoseFF與SephadexG-75兩種介質(zhì)更合理。 對漆酶部分動力學(xué)特征進(jìn)行測定：反應(yīng)過程曲線表明該漆酶符合酶促反應(yīng)動力學(xué)特征。粗漆酶最適反應(yīng)溫度為40℃，而純化漆酶較高為60℃；粗漆酶最適反應(yīng)pH值為6.0，純化漆酶為4.6。金屬離子對純化漆酶活力的影響

5、很大，當(dāng)金屬離子濃度為5mmol/L時(shí)，Na+、Ba2+對漆酶活力無明顯影響，F(xiàn)e2+、Fe3+對漆酶是完全的抑制作用，而Ca2+對漆酶有明顯的促進(jìn)作用。所測試濃度下的抑制劑乙二氨四乙酸和乙二氨四乙酸二鈉鹽對漆酶有完全的促進(jìn)作用，乙二氨四乙酸的濃度為10mmol/L時(shí)促進(jìn)作用最大，其活力為對照組活力的9.78倍；而硫脲、疊氮化鈉和二硫蘇糖醇在足夠低的濃度下對漆酶有一定的促進(jìn)作用，在較高定濃度下對漆酶完全抑制。該酶氧化丁香醛連氮的米氏常數(shù)