西瓜果實(shí)含糖量QTL定位及糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因功能初析.pdf

1、西瓜作為一種以鮮食為主的水果，果實(shí)含糖量是評(píng)價(jià)西瓜品質(zhì)的最核心指標(biāo)，一直是西瓜品種改良與栽培中最為重要的目標(biāo)性狀。然而，西瓜含糖量是由多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀，并存在明顯的環(huán)境互作效應(yīng)，傳統(tǒng)的生理與遺傳學(xué)研究方法很難分析其遺傳本質(zhì)與調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步明確在復(fù)雜的糖代謝和糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因網(wǎng)絡(luò)中哪些節(jié)點(diǎn)是影響和決定西瓜果實(shí)糖積累的關(guān)鍵基因，不僅可為西瓜品質(zhì)改良提供理論與技術(shù)指導(dǎo)，而且也為探索作物光合產(chǎn)物積累與轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，因此本項(xiàng)目研

2、究具有重要理論意義與實(shí)用價(jià)值。本文通過構(gòu)建高密度SNP遺傳圖譜與全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWAS）方法，完成含糖量性狀QTL精細(xì)定位，試圖明確西瓜含糖量遺傳控制位點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上，對(duì)QTL區(qū)域的糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的結(jié)構(gòu)變異、表達(dá)模式、亞細(xì)胞定位、功能驗(yàn)證和調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了初步分析，取得的主要研究結(jié)果如下。
　　1．西瓜整合圖譜構(gòu)建及含糖量QTL初定位。利用4個(gè)獨(dú)立的遺傳群體構(gòu)建了一張整合圖譜。4個(gè)獨(dú)立的遺傳群體分別為：東亞栽培種97103和野生

3、種PI296341-FR雜交單粒傳構(gòu)建的103株系重組自交系（RILs）；北美栽培種ZWRM50×野生種PI244019(ZWRM×citron)雜交構(gòu)建的182單株的F2群體；164株系的栽培種×栽培種[Klondike Black Seeded×New Hampshire Midget(KBS×NHM)] RIL群體；187單株的栽培種×半野生種[Strain II×PI560023(SII×egusi)] F2群體。該整合圖共計(jì)包

4、含標(biāo)記1339個(gè)，遺傳距離798cM，平均標(biāo)記間距0.6cM。整合圖譜共計(jì)包含58個(gè)已經(jīng)發(fā)表的QTL和12個(gè)新發(fā)現(xiàn)的QTL，其中新發(fā)現(xiàn)的QTL包括西瓜折光糖含量（Brix）、果糖（Fru）、蔗糖（Suc）和葡萄糖（Glu）含量QTL。通過整合圖譜將西瓜折光糖含量主效QTL（Brix）定位于chr2(QBRIX2-1、QBRIX2-2及QBRIX2-3)，該3個(gè)主效QTL均與果糖含量QTL(QFRU2-1、QFRU2-2和QFRU2-3)

5、重合。其中2個(gè)QTL(QBRIX2-1和QBRIX2-3)與蔗糖含量QTL（QSUC2-1和QSUC2-2）重合。通過整合比較分析不同群體下定位的含糖類QTL發(fā)現(xiàn)QBRIX2-1, QBRIX2-2及QBRIX2-3均能在不同遺傳背景下被檢測(cè)到，且位于整合圖譜同一區(qū)間，表明這些QTL能夠解釋廣泛背景下的遺傳變異。
　　2．RIL重測(cè)序SNP圖譜構(gòu)建與含糖量QTL精細(xì)定位。對(duì)栽培西瓜97103與野生西瓜PI296341-FR為親本構(gòu)

6、建的RIL群體96個(gè)單系進(jìn)行了重測(cè)序。從94.7萬個(gè)SNP位點(diǎn)選取高質(zhì)量的SNP構(gòu)建2777 Bin，利用2777 Bin構(gòu)建RIL SNP Bin遺傳圖，SNP遺傳圖共計(jì)包含SNP Bin2539個(gè)，遺傳距離總1565.0cM。利用超高密度RIL SNP Bin遺傳圖，將97103基因組386個(gè)scaffolds大約344 Mb(占組裝基因組355.2Mb的96.9％)錨定到西瓜11條染色體，共計(jì)有314 scaffolds(332.

7、6 Mb)大約占93.6%組裝序列確定方向，較西瓜基因組發(fā)表版本僅65%的scaffold確定方向有明顯提高。通過超高密度RIL SNP Bin圖將西瓜含糖量QBRIX2-1和QBRIX2-2分別精細(xì)定位在125 Kb（16 genes）和797 Kb(20 genes)之間。利用和高糖親本97103遺傳相似度高達(dá)84.3%的RIL-G35與97103構(gòu)建BC2F2近等基因系群體將QBRIX2-3進(jìn)一步定位到Indel標(biāo)記WMI251和

8、WMI233之間，包含87個(gè)基因，其中有6個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，其中bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子998在親本97103和PI296341中存在蛋白差異且判斷為有害突變，可能會(huì)影響基因功能。
　　3．QBRIX2-1區(qū)間轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因835轉(zhuǎn)錄水平、結(jié)構(gòu)變異、組織特異性表達(dá)及其與QBRIX2-3的互作模式解析。含糖量QBRIX2-1精細(xì)定位在125 Kb之間，涉及到16個(gè)候選基因。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)僅一個(gè)MSF家族轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因835在高糖材料97103果實(shí)

9、成熟4個(gè)關(guān)鍵時(shí)期高量上調(diào)表達(dá)，而在低糖材料PI296341果實(shí)成熟4個(gè)關(guān)鍵時(shí)期無表達(dá)，在97103果皮、根和葉部也呈低表達(dá)，Q-PCR檢測(cè)約50份典型重測(cè)序材料835表達(dá)發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量與含糖量正相關(guān)，確定為QBRIX2-1的候選基因。RACE擴(kuò)增835在高糖材料和低糖材料中全長(zhǎng)CDS及5’和3’端序列發(fā)現(xiàn)835在高糖材料5’UTR區(qū)up37bp存在一個(gè)SNP（A/C），可導(dǎo)致高糖材料和低糖材料翻譯框架改變：高糖材料減少45個(gè)氨基酸。檢測(cè)該

10、SNP在130份重測(cè)序材料中發(fā)現(xiàn)Brix大于4的材料均為A，而低于4的材料均為 C，不僅可區(qū)分栽培和野生種之間糖分差異，還能有效區(qū)分半野生資源內(nèi)部高糖和低糖材料，因此該SNP可作為自然群體糖分檢測(cè)的分子標(biāo)記互助選擇。45氨基酸短肽為信號(hào)肽，亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)其可影響97103-835和PI296341-835蛋白定位：97103-835蛋白表達(dá)在質(zhì)膜，而PI296341-835蛋白主要表達(dá)在內(nèi)膜系統(tǒng)。RNA原位雜交顯示97103-835特異

11、性在高糖品種果實(shí)維管束系統(tǒng)表達(dá)，這表明97103-835可能是參與果實(shí)韌皮部糖分卸載，而非果肉細(xì)胞糖分裝載。
　　為明確高糖材料97103和低糖材料PI296341中835數(shù)千倍差異表達(dá)的機(jī)制，分析啟動(dòng)子發(fā)現(xiàn)上游1187 bp存在一個(gè)MYC(bHLH) E-box（CANNTG）識(shí)別位點(diǎn)差異：CAAATG->CAAAGG。以此E-box位點(diǎn)為誘餌序列，篩選97103cDNA酵母單雜交文庫，發(fā)現(xiàn)位于QBRIX2-3的轉(zhuǎn)錄因子998可

12、結(jié)合該E-box元件。以煙草瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)共表達(dá)998和835啟動(dòng)子1700 bp啟動(dòng)的Luc熒光素蛋白，結(jié)果顯示998能有效激活97103-835啟動(dòng)子1700 bp，而不能激活PI296341-835啟動(dòng)子1700 bp區(qū)域。充分證明該基因啟動(dòng)子區(qū)域 E-box motif的 SNP改變導(dǎo)致了轉(zhuǎn)錄活性差異，從而明確QBRIX2-3對(duì)QBRIX2-1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制。
　　4．QBRIX2-2區(qū)間糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ClTST2的表達(dá)譜分

13、析、功能初析及調(diào)控因子。QBRIX2-2涉及20個(gè)候選基因，從蛋白功能注釋分析只有ClTST2屬于TMT家族糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)ClTST2在高糖材料97103果實(shí)成熟過程4個(gè)關(guān)鍵時(shí)期上調(diào)表達(dá)，而在低糖材料PI296341果實(shí)成熟4個(gè)關(guān)鍵時(shí)期下調(diào)表達(dá)，Q-PCR檢測(cè)約50份典型重測(cè)序材料ClTST2表達(dá)發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量與含糖量正相關(guān)，故將轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因ClTST2確定為QBRIX2-2的候選基因。將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)入帶YFP的植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)

14、化西瓜果實(shí)原生質(zhì)體，結(jié)果表明轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ClTST2在西瓜液泡中表達(dá)。膜片鉗技術(shù)檢測(cè)表明ClTST2具有單糖（葡萄糖、果糖）和二糖（蔗糖）轉(zhuǎn)運(yùn)功能；將ClTST2瞬時(shí)表達(dá)于草莓的白果期，表達(dá)3-4天后可以明顯觀察到ClTST2過表達(dá)草莓能夠較表達(dá)空載體的草莓積累1.5倍的糖分。酵母單雜交和EMSA結(jié)果表明WAKY家族ClSUSIBA2能有效結(jié)合ClTST2的W box和糖響應(yīng)順式作用元件。煙草瞬時(shí)表達(dá)發(fā)現(xiàn)97103-pClTST2::LUC

15、和PI296341-FR-pClTST2::LUC均被ClSUSIBA2抑制表達(dá)。分析其表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)ClTST2在低糖材料（組織）中被ClSUSIBA2抑制，而在高糖材料中，隨著果實(shí)成熟，不斷解除了其對(duì)ClTST2的抑制，使ClTST2表現(xiàn)出不斷升高的表達(dá)趨勢(shì)。
　　5．GWAS發(fā)現(xiàn)糖分積累相關(guān)基因ClSWT及其轉(zhuǎn)錄水平、功能解析。以130份重測(cè)序自然群體材料約100萬SNP數(shù)據(jù)進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，在Chr1短臂末端378844

16、附近獲得了西瓜糖分含量SNP，該SNP位于ClSWT，與130份重測(cè)序自然群體糖分含量吻合度達(dá)86%。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，ClSWT在高糖材料97103果實(shí)成熟4個(gè)關(guān)鍵時(shí)期高量上調(diào)表達(dá)，而在低糖材料PI296341果實(shí)成熟4個(gè)關(guān)鍵時(shí)期無表達(dá)，Q-PCR檢測(cè)約50份典型重測(cè)序材料ClSWT表達(dá)發(fā)現(xiàn)其表達(dá)量與含糖量正相關(guān)，確定為候選基因。ClSWT轉(zhuǎn)化己糖吸收缺陷酵母菌種Ysl2-1后，能互補(bǔ)其果糖和葡萄糖吸收功能，證明其具有果糖和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)能

17、力。
　　6．西瓜糖分積累機(jī)制網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)模式圖繪制。水蘇糖、棉籽糖是西瓜韌皮部運(yùn)輸?shù)闹饕欠郑?nbsp;主要由α-半乳糖苷酶(AGA)將水蘇糖、棉籽糖分解為蔗糖，此為糖分果實(shí)卸載第一關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。韌皮部維管束中蔗糖被酸性轉(zhuǎn)化酶分解成果糖和葡萄糖后從韌皮部卸載，此為糖分運(yùn)輸?shù)诙P(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，可能由QBRIX2-1835參與協(xié)助，并由bHLH家族轉(zhuǎn)錄因子控制表達(dá)。糖分運(yùn)輸?shù)谌P(guān)鍵節(jié)點(diǎn)為果肉細(xì)胞質(zhì)膜上糖分運(yùn)輸，為本研究已證明功能ClSWT控制。