甜橙糖轉運子基因分離及其在果實糖積累中的功能研究.pdf

1、可溶性糖，主要包括葡萄糖、果糖和蔗糖，是決定甜橙果實品質的重要營養(yǎng)成分。果實中積累的可溶性糖是在葉片中經光合作用合成，并由維管束韌皮部運輸而來。Sugar transporter是位于細胞膜或亞細胞器膜上跨膜轉運糖的載體蛋白，廣泛參與糖在源葉的韌皮部裝載，庫器官處的韌皮部卸載，庫組織細胞的糖吸收，和糖的跨液泡膜運輸，從而調控植株的糖轉運和積累。研究Sugar transporter基因對探討甜橙的糖轉運與分配，調控果實糖積累具有重要意義

2、。本研究針對甜橙果實發(fā)育過程中的可溶性糖積累，結合基因系統(tǒng)進化，表達分析，亞細胞定位，酵母功能互補，同位素標記和熒光標記等技術，分離甜橙Sugar transporter基因家族，研究其在果實糖積累中的功能，并探討相關的調控機制。以期篩選出參與果實糖積累的關鍵基因，進一步理解果實糖轉運和積累機制。主要研究結果如下:
　　(1)甜橙Sugar transporter基因家族克隆和表達分析
　　甜橙基因組中共分離77個Sugar

3、 transporter基因，編碼3個SUT，58個MST和16個SWEET轉運子。甜橙3個SUT成員分別屬于SUT1，SUT2和SUT4類型。58個MST可分為7個亞族，其中STP和ERD6L亞族發(fā)生基因串聯(lián)復制，導致家族成員大規(guī)模增加。STP亞族成員響應ABA和低溫的表達模式，反映其基因串聯(lián)復制可能與抵御逆境有關。大量Sugar transporter基因在葉片、花、果實和愈傷組織中表達，廣泛參與源和庫組織的糖轉運過程。在果實表達的

4、Sugar transporter基因，大部分隨果實糖積累過程上調表達，在果實糖積累中發(fā)揮重要作用。
　　(2)甜橙SUT家族功能鑒定和在‘紅暗柳'甜橙果實高蔗糖積累中的作用
　　酵母功能互補結果表明CsSUT1，CsSUT2和CsSUT4都具有蔗糖轉運活性。使用具有熒光的蔗糖類似物Esculin，證明CsSUT1是具有轉運活性的蔗糖質子同向轉運子，pH值為5.0時具有最大轉運活性。C14標記蔗糖檢測表明CsSUT4是蔗糖質

5、子同向轉運子，對蔗糖和麥芽糖特異運輸，pH值為4.0時對蔗糖具有最大轉運活性。解偶聯(lián)劑CCCP和細胞膜質子泵抑制劑釩酸鹽明顯抑制其轉運活性。亞細胞定位結果顯示CsSUT4定位于液泡膜。從蔗糖轉運和分配角度，對甜橙芽變‘紅暗柳'果實高糖積累機制進行初步探討。和親本‘暗柳'相比，‘紅暗柳'果實積累更高含量的蔗糖，淀粉積累相應減少?！t暗柳'源葉CsSUT1，CsSUT2和CsSUT4具有較高表達，促進了蔗糖的韌皮部裝載。相應地，‘紅暗柳'植

6、株韌皮部運輸?shù)恼崽呛扛哂凇盗??！t暗柳'果實CsSUT2具有較高的表達，促進了蔗糖在果實的韌皮部卸載?！t暗柳'果肉pH值達到5.8，遠高于‘暗柳'的pH值3.8，表明‘紅暗柳'果實CsSUT4轉運液泡蔗糖到胞質的活性減弱，蔗糖較多積累在液泡。氧化逆境誘導CsSUT2表達，說明CsSUT2在‘紅暗柳'果實中的高表達可能與‘紅暗柳'果實遭受更強的氧化逆境有關。
　　(3)液泡葡萄糖轉運子CsERD6L在果實糖積累中的功能與調控

7、機制
　　酵母功能互補表明在果實中表達的CsSTP13是葡萄糖和果糖轉運子，負責果實成熟期間質外體單糖的吸收。并建立熒光標記葡萄糖2NBDG檢測單糖轉運子轉運活性的方法?？寺RD6L亞家族的一個成員CsERD6L，在花中表達量最高，在源葉中微弱表達。亞細胞定位結果表明CsERD6L蛋白定位于液泡膜。酵母功能互補檢測表明CsERD6L不能恢復酵母生長。利用2NBDG檢測CsERD6L轉運活性，去除可能的液泡定位序列的CsERD6L

8、具有葡萄糖轉運活性，其轉運不依賴于pH值。超量表達CsERD6L的酵母細胞中葡萄糖含量降低，說明CsERD6L介導液泡葡萄糖向胞質轉運。CsERD6L與液泡酸性轉化酶Csb Fruct1在果實成熟期間上調表達，負責將液泡內蔗糖水解并運輸至胞質參與代謝活動。通過果肉處理，CsERD6L啟動子驅動報告基因表達和檢索基因芯片數(shù)據，表明CsERD6L受ABA，氧化逆境處理和糖饑餓逆境誘導表達。利用啟動子驅動報告基因表達探討了轉錄因子調控CsER

9、D6L表達的研究，ASR類轉錄因子CsASR和一個MYB轉錄因子Cs8912680未轉錄激活CsERD6L表達。CsERD6L和CsbFruct1-2在芽變‘紅暗柳'果實高表達，說明‘紅暗柳'果實在遭受更強的氧化逆境下，液泡中積累的大量蔗糖，被較多水解為單糖后運輸?shù)桨|。
　　綜上所述，本研究系統(tǒng)分離了甜橙糖轉運基因家族，驗證了參與果實糖轉運和積累的關鍵候選基因的功能，并探討了其調控模式。從糖轉運的角度，探討了SUT家族在‘紅暗柳