FGL2在T細(xì)胞免疫應(yīng)答中以及TCF-1和LEF-1協(xié)同調(diào)控TFH細(xì)胞功能的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景與目的：
　　濾泡輔助T細(xì)胞(follicular helper T cells，TFH)是CD4+輔助T細(xì)胞的一個(gè)特殊亞群，它在生發(fā)中心反應(yīng)(germinar center，GC)的建立，GC B細(xì)胞通過高親和力抗原受體的選擇，選擇性分化為記憶B細(xì)胞和長壽命漿細(xì)胞的過程中起到了關(guān)鍵的作用。TFH細(xì)胞分化是一個(gè)多階段、多因子參與的過程[1]，包含了Bcl6和其他一些轉(zhuǎn)錄因子，其中Bcl6在TFH細(xì)胞分化過程中起到了決定性的

2、作用[2]。此外TCF-1、IRF4、Batf、 Ascl2和STATs都參與到了TFH細(xì)胞的分化調(diào)控[1]。
　　FGL2，纖維蛋白原樣2凝血酶原酶，又稱纖維介素(Fibroleukin)。分為膜相關(guān)蛋白(mFGL2)和分泌蛋白(sFGL2)兩型。mFGL2能夠?qū)⒛剞D(zhuǎn)變?yōu)槟浮FGL2可抑制HBV病人CD8+T細(xì)胞的增生和功能[3]。同時(shí)，它還維持了TReg細(xì)胞的活性，體外實(shí)驗(yàn)中抑制了T細(xì)胞增生[4]。然而FGL2在體內(nèi)

3、對于T細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響還未見報(bào)道。
　　T細(xì)胞因子1(TCF-1，Tcf7基因編碼)和淋巴增強(qiáng)結(jié)合因子1(LEF-1，Lef1基因編碼)是經(jīng)典Wnt通路的下游效應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子，在胸腺細(xì)胞發(fā)育、T細(xì)胞分化和記憶CD8+T的維持上起到重要作用[5，6]。LEF-1和TCF-1在CD4+CD8+雙陽階段，決定了胸腺細(xì)胞向CD4+T或者CD8+T方向分化[7，8]。在成熟的CD8+T細(xì)胞，TCF-1在記憶CD8+T細(xì)胞的維持中發(fā)揮了重要的作

4、用，并協(xié)同LEF-1調(diào)控了記憶前體細(xì)胞的形成和記憶CD8+T細(xì)胞的再次應(yīng)答能力[9-11]。在成熟的CD4+T細(xì)胞，TCF-1通過上調(diào)GATA-3的表達(dá)促進(jìn)了TH2細(xì)胞的分化[12]。TCF-1的表達(dá)在發(fā)育的胸腺細(xì)胞和活化的CD4+T細(xì)胞中限制了IL-17A的表達(dá)[13]。在淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(LCMV)急性感染模型中，TCF-1通過調(diào)控Bcl6-Blimp1軸啟動(dòng)了TFH細(xì)胞的分化[15]。然而，TCF-1和LEF-1在蛋白免疫

5、過程中對于TFH細(xì)胞的分化和功能的影響也未見報(bào)道。
　　因此，本課題重點(diǎn)研究在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中FGL2對T細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響以及在蛋白免疫過程中TCF-1和LEF-1對TFH細(xì)胞分化和功能的作用。
　　本研究的主要內(nèi)容:
　　1.FGL2在急性病毒感染過程中對T細(xì)胞免疫應(yīng)答的影響
　　我們首先檢測了LCMV感染后，血漿中FGL2的變化情況。結(jié)果顯示LCMVArmstrong急性感染后第3、5和8天，小鼠血漿中的FG

6、L2濃度分別上調(diào)了65％、111％、151％。為了驗(yàn)證FGL2的上調(diào)是否對T細(xì)胞的免疫應(yīng)答產(chǎn)生影響，我們用LCMV感染Fgl2基因敲除小鼠和C57BL/6J小鼠，第8天檢測T細(xì)胞的增殖、分化和功能。我們還過繼轉(zhuǎn)移SMARTA小鼠細(xì)胞（具有特異性識(shí)別LCMV GP66-77表位的TCR的CD4+T細(xì)胞）和P14小鼠細(xì)胞（具有特異性識(shí)別LCMV GP33-41表位的TCR的CD8+T細(xì)胞）到Fgl2基因敲除小鼠和C57BL/6J小鼠體內(nèi)，檢

7、測了FGL2作為外源性影響因素對T細(xì)胞增殖、分化和功能的影響。結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組和對照組TFH細(xì)胞、TH1細(xì)胞和效應(yīng)CD8+T細(xì)胞的頻率和數(shù)量均無明顯差異(p＞0.05）。結(jié)論提示了在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，雖然FGL2在急性病毒感染模型中表達(dá)上調(diào)，但FGL2不影響T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。
　　2.TCF-1和LEF-1在蛋白免疫過程中協(xié)同調(diào)控TFH細(xì)胞的功能
　　我們用NP-CGG或融合LCMV GP66-77表位的GST蛋白(GST-GP6

8、6-77)與弗氏佐劑混合，分別免疫已經(jīng)被Tamoxifen誘導(dǎo)敲除的Lef1fl/+Tcf7fl/+(Ctrl)、Lef1-/-Tcf7-/-(DKO)、Lef1-/-Tcf7fl/+(LKO)和Lef1fl/+Tcf7-/-(TKO)小鼠。免疫后第8天，檢測小鼠腹股溝淋巴結(jié)中TFH細(xì)胞的頻率和GC B細(xì)胞的頻率。結(jié)果顯示:在NP-CGG蛋白免疫條件下，和Ctrl組相比，DKO、LKO和TKO組的TFH細(xì)胞的頻率均無明顯變化(p＞0.0

9、5）。TKO組的GC B細(xì)胞的頻率下降了約40％，DKO組下降了約80％(p＜0.001)。
　　我們認(rèn)為，GC B細(xì)胞頻率的降低可能有兩種原因:1、B細(xì)胞中的TCF-1和LEF-1同時(shí)也被Tamoxifen誘導(dǎo)敲除了，從而導(dǎo)致GC B細(xì)胞頻率的降低;2、TCF-1和LEF-1在蛋白免疫過程中協(xié)同調(diào)控了TFH細(xì)胞的功能，從而影響了GC B細(xì)胞的分化。下一步，我們將利用過繼轉(zhuǎn)移SMARTA細(xì)胞或B1-8Hi細(xì)胞（特異性識(shí)別NP表位的

10、B細(xì)胞）以及體外共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)來研究GC B細(xì)胞頻率下降的原因并探求TCF-1和LEF-1在其中發(fā)揮功能的分子機(jī)制。
　　總結(jié):
　　我們證實(shí)了在LCMV感染后，血漿中FGL2的表達(dá)上調(diào)，但這種上調(diào)在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中不影響T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。在NP-CGG蛋白免疫模型中，和Ctrl組相比，DKO、LKO和TKO組的TFH細(xì)胞的頻率均無明顯變化，而TKO組的GC B細(xì)胞的頻率下降了約40％，DKO組下降了約80％。這種降低是因?yàn)門CF-1