中國水仙遺傳轉(zhuǎn)化及花色素成分分析.pdf

1、中國水仙(Narcissus tazetta vac chinensis)是石蒜科水仙屬多年生草本植物,是我國著名的十大傳統(tǒng)名花之一,其花清新高雅,造型美觀,是冬春重要的時(shí)令花卉,深受人們喜愛。但長期以來中國水仙存在花色單一、品種單一等問題,不能滿足市場的需求。通過轉(zhuǎn)基因手段對水仙進(jìn)行品種改良是一條有效的途徑。本研究以福建漳州水仙為材料,在以中國水仙花葶為試材建立高效再生體系的基礎(chǔ)上,初步研究了中國水仙以花葶作為受體材料的遺傳轉(zhuǎn)化體系，

2、并提取了漳州水仙花色素,運(yùn)用高效液相色譜法(HPLC)分析了花瓣和副冠中色素成分和含量,研究結(jié)果為利用基因工程手段培育中國水仙新品種奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　 ⑴花葶取材:中國水仙花葶在11月中下旬花芽分化完成之后才開始伸長生長。12月、1月和2月份的花葶的長度和成熟度不同,且下端與鱗莖相連幼嫩的部位誘導(dǎo)芽的能力強(qiáng)。取12月份花葶1 cm左右,1月份是1-1.5 cm,則2月份的花葶較長可以取1.5 cm左右,將花葶切成

3、1.2mm薄片作為外植體。
　　 ⑵花葶為外植體高效再生體系的建立:試驗(yàn)對不同時(shí)期的花葶直接誘導(dǎo)芽進(jìn)行了研究,并建立了適合于轉(zhuǎn)基因研究的高效再生體系。比較3個(gè)不同時(shí)期花葶直接誘導(dǎo)芽的能力;12月份花葶以MS基本培養(yǎng)基附加激素5 mg·L-1BA、0.3mg·L-1NAA誘導(dǎo)不定芽效果較好;1月份花葶以MS+5 mg·L-1 BA+0.3 mg·L-1NAA或MS+3 mg·L-1BA+0.5 mg·L-1NAA兩種培養(yǎng)基較好;2

4、月份花葶在培養(yǎng)基MS+3 mg·L-1BA+0.5 mg·L-1NAA上不定芽分化較好。三個(gè)時(shí)期花葶不定芽誘導(dǎo)率都達(dá)到90％以上,分化系數(shù)達(dá)到5以上。研究還發(fā)現(xiàn)花葶在接種時(shí)需要將形態(tài)學(xué)上端朝上放置才易誘導(dǎo)出芽。不定芽在MS+0.5 mg·L-1 BA+0.3 mg·L-1NAA壯苗培養(yǎng)基上可生長成健壯的小鱗莖。
　　 ⑶花葶為外植體遺傳轉(zhuǎn)化初步研究:用農(nóng)桿菌EHA105/pCMBIA2300-35S-LLFY-OCS對中國水仙進(jìn)

5、行轉(zhuǎn)化。抑菌劑濃度梯度試驗(yàn)結(jié)果顯示羧芐青霉素在濃度為300 mg·L-1頭孢霉素在濃度500 nag·L-1時(shí)就可以抑制根癌農(nóng)桿菌的生長;抗生素濃度梯度試驗(yàn)結(jié)果表明30 mg·L-1卡那霉素濃度適合于轉(zhuǎn)化后的篩選。對影響轉(zhuǎn)化的因素進(jìn)行了比較研究,花葶在MS+5mg·L-1BA+0.5mg·L-1NAA+3％蔗糖培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)6 d后,用OD600值為0.4的農(nóng)桿菌重懸液濃度侵染30 min,共培養(yǎng)4 d后,轉(zhuǎn)入篩選培養(yǎng)基MS+5 mg·

6、L-1BA+0.5 mg·L-1NAA+30 mg·L-1Kan+300 mg·L-1Cady+3％蔗糖進(jìn)行篩選,能獲得較多抗性芽。
　　 ⑷花色素成分分析:對漳州水仙花的白色花瓣和黃色副冠的類胡蘿卜素類色素進(jìn)行提取,采用高效液相色譜法(HPLC)分析成分并測定了其含量。提取液甲醇、乙酸乙酯、石油醚體積比為1:1:1混合,在低溫條件下可將類胡蘿卜素很好的分離。色譜條件為色譜柱Luna(C18)反相柱(5 gm4.6*250 mm