不同速度增加的單向流體剪應(yīng)力調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞F-actin重組及相關(guān)研究.pdf

1、流體剪應(yīng)力作用下，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的分化趨勢及機(jī)制被越來越多關(guān)注和研究。本實驗室之前的實驗結(jié)果表明不同增加速度的單向流體剪應(yīng)力同時調(diào)控了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化方向和細(xì)胞骨架F-actin的重排。本論文以此為基礎(chǔ)，探討了不同速度增加的單向流體剪應(yīng)力在調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化過程中細(xì)胞骨架F-actin重組裝對該機(jī)制的調(diào)控作用，進(jìn)一步考察了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在不同增加速度的單向流體剪應(yīng)力作用下力學(xué)敏感型鈣離子通道對F-actin重

2、組裝的影響。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下：
　　以6周齡Sprague Dawley大鼠來源的第三、四代MSCs為實驗研究對象，使用平板流動腔裝置對細(xì)胞骨架固定劑鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）預(yù)處理后的 MSCs施加三種不同增加速度的單向流體剪應(yīng)力,即0分鐘從0 dyn/cm2線性增加到10 dyn/cm2、2分鐘從0 dyn/cm2線性增加到10 dyn/cm2、20分鐘從0 dyn/cm2線性增加到10 dyn/cm2（分別簡化為

3、0-0’、0-2’、0-20’）。完成20分鐘力學(xué)加載并通過熒光染色即時觀察細(xì)胞骨架F-actin聚合情況并量化其熒光強(qiáng)度得到細(xì)胞骨架F-actin聚合程度的數(shù)據(jù)。結(jié)果顯示，Phalloidin抑制組的細(xì)胞連續(xù)F-actin的量化結(jié)果均大于靜態(tài)對照組，但均小于相同加載方式下而未進(jìn)行預(yù)處理的實驗組，說明不同線性增加的單向流體剪應(yīng)力調(diào)控了MSCs細(xì)胞骨架F-actin的重排，且0-2’加載方式使MSCs的F-actin聚合度最大，相比之下0

4、-20’力學(xué)刺激方式對細(xì)胞骨架F-actin聚合度影響最小。加載條件下Phalloidin不能完全抑制F-actin重排。
　　在發(fā)現(xiàn)上述結(jié)果后，為考察細(xì)胞骨架F-actin在不同增加速度的單向流體剪應(yīng)力調(diào)控MSCs分化中的作用，本文分別檢測了MSCs的成骨向（堿性磷酸酶，ALP）和軟骨向（糖胺聚糖，GAG）分化標(biāo)志物。結(jié)果表明，三種加載方式作用于MSCs20分鐘并靜態(tài)培養(yǎng)48小時后，在Phalloidin非抑制組中實驗結(jié)果與課題

5、組已得到的結(jié)論一致，即0-2’加載組的 ALP表達(dá)最多，且與其他組包括靜態(tài)組均有顯著性差異；而0-0’加載組的GAG表達(dá)結(jié)果最大，且與其他組包括靜態(tài)組均有顯著性差異。所以我們認(rèn)為0-2’力學(xué)刺激可促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞系分化，0-0’力學(xué)刺激則可促進(jìn)MSCs向軟骨細(xì)胞系分化；而Phalloidin抑制組中三種方式的力學(xué)加載組的ALP和GAG量化結(jié)果之間均沒有顯著差異性。表明不同增加速度的單向流體剪應(yīng)力通過調(diào)控細(xì)胞骨架F-actin重組進(jìn)

6、而影響了MSCs成骨向和軟骨向分化趨勢。為進(jìn)一步探討Phalloidin試劑對MSCs分化的影響同樣使用細(xì)胞骨架F-actin穩(wěn)定劑 Phalloidin預(yù)處理 MSCs并完成三種方式力學(xué)加載，分別用含有和不含有Phalloidin的培養(yǎng)基靜態(tài)培養(yǎng)48小時后檢測細(xì)胞ALP及GAG的含量。我們發(fā)現(xiàn)在含有和不含有Phalloidin試劑的兩種靜態(tài)培養(yǎng)條件下，各加載組之間ALP和GAG量化結(jié)果并沒有差異性，說明Phalloidin試劑本身對細(xì)

7、胞ALP和GAG的表達(dá)沒有影響，同時也驗證了之前我們得到的結(jié)論，不同增加速度的單向流體剪應(yīng)力通過影響細(xì)胞骨架F-actin重組進(jìn)而調(diào)控了MSCs成骨向和軟骨向分化趨勢。
　　實驗室前期研究已發(fā)現(xiàn)，力學(xué)敏感型鈣離子通道與細(xì)胞骨架F-actin重排有著密切關(guān)系。但與MSCs的分化是否相關(guān)以及該通道是否通過F-actin重排調(diào)控MSCs分化尚不知曉。基于此，我們在力學(xué)加載前用力學(xué)敏感型鈣離子通道阻滯劑GdCl3作用MSCs以實現(xiàn)阻滯作用

8、，20分鐘的力學(xué)加載后48小時靜態(tài)培養(yǎng)，檢測MSCs骨向和軟骨向分化標(biāo)志物的表達(dá)水平。通過比較力學(xué)敏感型鈣離子通道阻滯劑作用的實驗組和未進(jìn)行阻滯作用的實驗組的分化標(biāo)志物的表達(dá)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)MSCs受到不同速度增加的單向流體剪應(yīng)力加載作用時，細(xì)胞骨架F-actin的響應(yīng)有賴于力學(xué)敏感型鈣離子通道不同程度的開放。
　　綜合上述研究結(jié)果，不同增加速度的單向流體剪應(yīng)力通過 MSCs力學(xué)敏感型鈣離子通道調(diào)控細(xì)胞骨架F-actin重組進(jìn)而調(diào)控