應(yīng)激耐受多系分化細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定及表皮三維模型的構(gòu)建.pdf

1、目的：（1）觀察正常人真皮成纖維細(xì)胞（Normal human dermal fibroblasts，NHDFs）對(duì)胰蛋白酶的耐受能力，分離、純化獲取真皮來源的應(yīng)激耐受多系分化細(xì)胞（Multilineage-differentiating stress-enduring(Muse)cells，Muse細(xì)胞），探索Muse細(xì)胞在自我更新、多能性標(biāo)記、分化潛能及甲基化程度等方面的生物學(xué)特性。（2）應(yīng)用聚己內(nèi)酯（Poly(ε–caprolac

2、tone)，PCL）作為人表皮細(xì)胞的體外三維培養(yǎng)支架，觀察細(xì)胞在液-氣界面培養(yǎng)時(shí)的生長(zhǎng)情況和生物學(xué)性狀，探討PCL作為三維支架的生物相容性，及液-氣界面培養(yǎng)三維細(xì)胞的可行性。
　　方法：（1）獲取 NHDFs，0.25％胰酶/0.02% EDTA處理16h，甲基纖維素（Methylcellulose，MC）培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)，獲取擬胚體樣Muse細(xì)胞簇，進(jìn)行干細(xì)胞相關(guān)抗體（Oct4，Sox2，Nanog和SSEA3）熒光染色、甲基化檢

3、測(cè)、透射電鏡觀察和三胚層誘導(dǎo)分化等。其中Muse細(xì)胞簇貼壁培養(yǎng)5-7天后，進(jìn)行堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AP）染色和干細(xì)胞相關(guān)抗體熒光染色。（2）將第3代胎兒頭皮來源的角質(zhì)形成細(xì)胞（Keratinocytes，KCs）和黑素細(xì)胞（Melanocytes，MCs)接種到PCL支架上，培養(yǎng)2周以構(gòu)建三維（three-dimensional，3D）表皮模型，進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin&eosin(H&

4、E)）染色、免疫細(xì)胞化學(xué)染色（CK15、Ki-67、CD34、CD200和HMB45）及透射電鏡觀察。
　　結(jié)果：（1）NHDFs增殖旺盛，0.25%胰酶/0.02%EDTA消化16h后大部分細(xì)胞死亡，僅少部分細(xì)胞存活，轉(zhuǎn)移至 MC培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)，5-7天后形成擬胚體樣 Muse細(xì)胞簇。分離、純化獲取Muse細(xì)胞簇，貼壁培養(yǎng)后細(xì)胞迅速擴(kuò)增，向外發(fā)散形成子代細(xì)胞，進(jìn)行AP染色顯示中間細(xì)胞簇部分呈紫藍(lán)色，向外擴(kuò)散著色變淺或不著色；干細(xì)

5、胞相關(guān)抗體熒光染色顯示中央球體部分熒光較強(qiáng)，向外擴(kuò)展熒光逐漸減弱。懸浮培養(yǎng)的Muse細(xì)胞簇干細(xì)胞表面標(biāo)記物熒光染色陽(yáng)性；與NHDFs相比，Oct4和Nanog基因位點(diǎn)甲基化程度低；透射電鏡觀察可見Muse細(xì)胞較原始，核漿比值高，核仁較大，細(xì)胞器較少且相對(duì)不成熟。Muse細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化時(shí)，代表中胚層的成脂誘導(dǎo)的油紅染色和成骨誘導(dǎo)的茜素紅染色陽(yáng)性，外胚層神經(jīng)元標(biāo)記抗體（nestin、neurofilament和b-III tubuli

6、n）染色陽(yáng)性，代表內(nèi)胚層的肝細(xì)胞誘導(dǎo)的白蛋白（albumin）染色陽(yáng)性。（2）KCs和MCs在共培養(yǎng)體系中生長(zhǎng)良好。H&E染色結(jié)果顯示KCs形成復(fù)層同心圓結(jié)構(gòu)，表面明顯角化，形成不完全的毛囊樣結(jié)構(gòu)。免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示零散分布的少數(shù)細(xì)胞分別表達(dá)CK15、CD34、CD200、Ki-67和 HMB45。透射電鏡結(jié)果顯示KCs包含大量角蛋白纖維（Keratin fibrils，KFs）和膜包被顆粒，部分KCs胞質(zhì)內(nèi)含有橢圓形或圓形電子致密顆