雙特異性磷酸酶1(DUSP1)在重度子癇前期中的作用研究.pdf

1、目的：
　　本研究首先選擇臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，觀察DUSP1及HIF-1α蛋白在早孕絨毛及靜脈血中的水平，以及不同孕周足月孕及重度子癇前期組(severepre-eclampsia，sPE)患者胎盤及靜脈血中的表達(dá)，通過(guò)體外試驗(yàn)，對(duì)BeWo滋養(yǎng)細(xì)胞株進(jìn)行低氧培養(yǎng)，模擬PE的狀態(tài)，研究DUSP1與HIF-1α蛋白及mRNA表達(dá)之間的關(guān)系，通過(guò)BeWo細(xì)胞中DUSP1過(guò)表達(dá)及基因沉默，研究在改變DUSP1的表達(dá)對(duì)HIF-1α表達(dá)的影響，

2、以及DUSP1基因表達(dá)改變對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲及增殖功能的影響，探討DUSP1對(duì)HIF-1α的調(diào)控作用。本研究的完成為PE的早期診斷提供新的思路;為深入了解DUSP1在PE發(fā)生機(jī)制中的作用闡明其分子理論。
　　方法：
　　第一部分:臨床研究部分。臨床分組:選擇2013年1月至2014年5月，在我院診治的孕婦，共分為三組:(1)正常早孕組，選擇孕5～10周的自愿終止妊娠的孕婦，共94例。(2)正常足月妊娠組，選擇妊娠37周至42周孕

3、婦，共90例。(3) sPE組，在我院產(chǎn)科確診為sPE的患者并排除以下疾病者:腎病、糖尿病、哮喘、肝炎等疾病史的患者，共70例。所有早孕組患者收集絨毛及靜脈血，所有足月妊娠及sPE組患者均收集胎盤組織、靜脈血及臍血標(biāo)本。同時(shí)記錄所有患者的年齡、孕產(chǎn)次、文化程度、孕周、新生兒出生情況（如Apgar評(píng)分、體重及身長(zhǎng)）。檢測(cè)DUSP1及HIF-1α蛋白及mRNA含量及表達(dá)變化。檢測(cè)方法:利用W.B及免疫組化檢測(cè)胎盤組織中的蛋白變化;利用ELI

4、SA方法了解靜脈血中的蛋白濃度變化情況;利用Q-PCR檢測(cè)組織中mRNA的表達(dá)情況。將上述結(jié)果進(jìn)行多因素分析，探討與PE的關(guān)系。
　　第二部分:檢測(cè)在常氧和低氧時(shí)，BeWo滋養(yǎng)細(xì)胞株DUSP1及HIF-1α蛋白及mRNA的表達(dá)變化、增殖力和侵襲力的變化，了解DUSP1及HIF-1α與滋養(yǎng)細(xì)胞功能之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)分組:常氧組:指在氧濃度為20％條件下培養(yǎng)BeWo滋養(yǎng)細(xì)胞。低氧組:指在1％氧濃度情況下培養(yǎng)BeWo滋養(yǎng)細(xì)胞。分別取常氧組

5、和低氧組不同培養(yǎng)時(shí)間(24h、36h、48h、60h、72h)的BeWo滋養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行如下檢測(cè):利用W.B對(duì)DUSP1及HIF-1α蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，利用Q-PCR對(duì)DUSP1及HIF-1α mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，利用CCK8對(duì)進(jìn)行細(xì)胞增殖力檢測(cè)，利用Transwell進(jìn)行細(xì)胞侵襲力的檢測(cè)。
　　第三部分:觀察改變DUSP1的表達(dá)對(duì)BeWo滋養(yǎng)細(xì)胞株HIF-1α表達(dá)、細(xì)胞侵襲及增殖力的影響。方法:構(gòu)建DUSP1過(guò)表達(dá)載體及基因沉默載

6、體，分別轉(zhuǎn)染BeWo滋養(yǎng)細(xì)胞株，檢測(cè)磷酸化ERK及HIF-1α蛋白及mRNA的表達(dá)變化以及BeWo滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力和增殖能力的變化。蛋白含量檢測(cè)、mRNA檢測(cè)、侵襲力及增殖力檢測(cè)的方法同第二部分。
　　結(jié)果:
　　1、對(duì)臨床病例檢測(cè)DUSP1及HIF-1α表達(dá)結(jié)果顯示，sPE組胎盤組織及靜脈血中DUSP1蛋白及mRNA表達(dá)明顯低于足月孕組，sPE組胎盤組織及靜脈血HIF-1α含量明顯高于足月孕組。各組結(jié)果如下:
　　(1

7、)ELISA檢測(cè)早孕組絨毛、足月孕組及sPE組的胎盤組織中DUSP1濃度分別為:824.22±236.17，1058.43±266.23及774.12±144.76pg/ml，其中sPE組胎盤組織中DUSP1濃度明顯低于正常足月孕胎盤中的濃度。在早孕組絨毛組織、足月孕及sPE組胎盤組織中HIF-1α蛋白濃度分別為264.42±66.23、155.25±36.60及314.42±44.76 pg/ml。sPE胎盤組織中HIF-1α蛋白濃度

8、明顯高于正常足月孕胎盤中的含量。三組靜脈血中DUSP1濃度分別為:222.58±101.26，237.62±86.72，214.03±108.54 pg/ml。sPE組靜脈血中DUSP1濃度明顯低于足月孕組。靜脈血中的HIF-1α蛋白含量分別為:20.60±7.80，17.05±4.26，27.86±5.54 pg/ml，正常早孕及sPE患者靜脈血中HIF-1α蛋白濃度升高，足月孕時(shí)明顯降低。
　　(2)利用W.B進(jìn)行DUSP1及

9、HIF-1α蛋白表達(dá)的檢測(cè)，DUSP1相對(duì)(a-TUBLIN)灰度平均值在早孕組絨毛、足月孕組及sPE組胎盤中分別為0.1299±0.036，0.5256±0.187及0.1378±0.069。利用灰度值比較，早孕組絨毛及sPE組胎盤中較正常足月孕組的胎盤中DUSP1明顯降低。早孕組絨毛、足月孕組及sPE組胎盤中HIF-1α相對(duì)灰度分別為為1.5±0.34，0.6±0.22，1.9±0.42。利用相對(duì)灰度值比較，HIF-1α蛋白在早孕組

10、絨毛及sPE組胎盤中明顯高于足月孕組胎盤中的表達(dá)。
　　(3)利用Q-PCR對(duì)DUSP1 mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，早孕組絨毛、足月孕及sPE組胎盤各組相對(duì)濃度值結(jié)果分別為:0.0263±0.0082、0.3535±0.0142、0.0062±0.0018，足月孕組胎盤中的DUSP1 mRNA較早孕組絨毛及sPE組胎盤中的明顯升高。Q-PCR檢測(cè)HIF-1αmRNA表達(dá)結(jié)果為:早孕組絨毛、足月孕及sPE組胎盤各組相對(duì)濃度值結(jié)果分別為:

11、0.326±0.036，0.239±0.038、0.445±0.052，sPE組胎盤中的結(jié)果高于正常足月孕組胎盤中的表達(dá)。
　　(4)利用免疫組化對(duì)DUSP1及HIF-1α蛋白進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)DUSP1蛋白的定位，在滋養(yǎng)細(xì)胞的胞膜中及胞核中表達(dá)明顯，sPE組胎盤中的表達(dá)明顯低于正常足月孕組。胎盤組織中HIF-1α的陽(yáng)性表達(dá)主要分布于胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的胞核或胞漿內(nèi)可見深棕色或淡黃色顆粒，sPE組HIF-1α蛋白陽(yáng)性著色細(xì)胞數(shù)明顯高于正常足月

12、孕組。
　　2、在低氧及常氧條件培養(yǎng)不同時(shí)間后的BeWo細(xì)胞中，分別在培養(yǎng)24h，36h，48h，60h，72h時(shí)，檢測(cè)DUSP1蛋白及mRNA水平，發(fā)現(xiàn)低氧組較常氧培養(yǎng)時(shí)降低，而且隨著低氧時(shí)間延長(zhǎng)，DUSP1的表達(dá)進(jìn)一步下降，在培養(yǎng)48h后，這種差異更明顯。在低氧培養(yǎng)的BeWo細(xì)胞中HIF-1α蛋白及mRNA表達(dá)較常氧組升高，隨著低氧時(shí)間延長(zhǎng)，HIF-1α蛋白及mRNA表達(dá)均進(jìn)一步升高，在培養(yǎng)48h后，兩種蛋白的表達(dá)在常氧組及低

13、氧組有明顯差異。Transwell檢測(cè)發(fā)現(xiàn)低氧培養(yǎng)的BeWo滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲力較常氧時(shí)明顯減弱，CCK8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，低氧培養(yǎng)時(shí)，滋養(yǎng)細(xì)胞增殖力有增強(qiáng)的趨勢(shì)。
　　3、在DUSP1過(guò)表達(dá)BeWo細(xì)胞，P-ERK及HIF-1α蛋白及mRNA的表達(dá)量均降低，Transwell檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞侵襲力增強(qiáng)，CCK8檢測(cè)其增殖力減弱;而在DUSP1基因沉默載體轉(zhuǎn)染后的BeWo細(xì)胞中，P-ERK及HIF-1α表達(dá)均升高。Transwell檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該細(xì)

14、胞的侵襲力減弱，CCK8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其增殖力增強(qiáng)。
　　結(jié)論：
　　1、DUSP1蛋白及mRNA在sPE組胎盤組織中的表達(dá)明顯低于正常足月孕組，HIF-1α蛋白及mRNA的表達(dá)在sPE組胎盤中明顯高于正常足月孕組，提示DUSP1及HIF-1α與sPE的胎盤異常發(fā)育過(guò)程有一定的相關(guān)。
　　2、常氧條件培養(yǎng)的BeWo細(xì)胞中，DUSP1及HIF-1α蛋白及mRNA表達(dá)較恒定，1％氧濃度時(shí)，DUSP1表達(dá)明顯降低，HIF-1α表達(dá)

15、升高，滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力下降，表明氧濃度的變化可能是導(dǎo)致PE胎盤淺著床的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一，提示調(diào)節(jié)氧濃度，改變局部氧狀況，有望阻止PE的發(fā)生。
　　3、利用DUSP1濃度調(diào)控后的BeWo細(xì)胞株，研究發(fā)現(xiàn)DUSP1降低的BeWo細(xì)胞中，磷酸化ERK和HIF-1α蛋白及mRNA表達(dá)明顯上升，細(xì)胞的侵襲力降低。提示DUSP1濃度的變化影響滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力可能是PE胎盤淺著床的環(huán)節(jié)之一。因此，推斷DUSP1的表達(dá)變化，可能是通過(guò)磷酸化ERK和HIF