雙特異性磷酸酶12及二硫鍵形成蛋白A類似蛋白與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、研究目的： 研究雙特異性磷酸酶12和二硫鍵形成蛋白A類似蛋白基因單核苷酸多態(tài)性與糖尿病的關(guān)系，初步探討二硫鍵形成蛋白A類似蛋白在糖尿病發(fā)病機制中的作用。 (1)葡萄糖激酶是肝臟糖脂代謝的關(guān)鍵酶。葡萄糖激酶相關(guān)雙特異性磷酸酶12(DUSP12)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種表達于肝臟，能夠與葡萄糖激酶特異性結(jié)合并且催化其磷酸化的磷酸酶。編碼DUSP12的基因位于染色體1q21-23區(qū)域內(nèi)，有研究表明該區(qū)域有與2型糖尿病密切相關(guān)的遺傳關(guān)

2、聯(lián)位點。因此，DUSP12及其基因單核苷酸多態(tài)性是否可能與肝胰島素敏感性及糖尿病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)?本研究旨在探討DUSP12基因多態(tài)性與中國人2型糖尿病的關(guān)系。 (2)二硫鍵形成蛋白A(DsbA)類似蛋白(DsbA-L)與DsbA具有高度相似的蛋白質(zhì)一級和高級結(jié)構(gòu)，后者是一種具有催化分泌蛋白質(zhì)二硫鍵形成功能的強氧化酶。因此，DsbA-L很可能也具有催化二硫鍵形成的功能，并且已有研究發(fā)現(xiàn)DsbA-L可以增加高分子量脂聯(lián)素的分泌。成熟

3、胰島素有3個二硫鍵，與正常胰島素功能密切相關(guān)。這提示DsbA-L與胰島素的形成可能有關(guān)。本研究首先探討了DsbA-L基因與胰島素生物合成及分泌以及與2型糖尿病的關(guān)系。其次，本研究還在細胞水平上對DsbA-L蛋白的功能進行初步研究。 研究對象與方法： (1)社區(qū)流行病學調(diào)查人群及醫(yī)院門診人群中選取577例上海地區(qū)中國人，其中糖耐量正常者359名，新診斷2型糖尿病患者218例；檢測目標人群的身高、體重等人體測量學指標，受試者

4、均進行口服糖耐量試驗(OGTT)，檢測糖脂代謝及胰島素水平等血漿或者血清參數(shù)，用MRI檢測受試者腹部皮下脂肪面積及腹內(nèi)脂肪面積，用生物電阻抗法檢測受試者體脂含量；用聚合酶鏈反應-限制性內(nèi)切酶(PCR-RFLP)方法檢測DUSP12基因-6735T/C變異。 (2)隨機選取589名正常糖耐量者及556名2型糖尿病患者，并且進一步按照BMI將兩組均分成正常體重亞組(BMI<24 kg/m2)和超重/肥胖亞組(BMI≥24 kg/m2

5、)；對受試者進行人體測量學檢測及OGTT檢查，檢測血漿或者血清中的糖脂代謝相關(guān)指標，檢查受試者腹部皮下及腹內(nèi)脂肪面積；測序檢測OsbA-L基因中8個外顯子及側(cè)翼內(nèi)含子區(qū)遺傳變異位點；用PCR-RFLP法檢測OsbA-L基因SNP-1308G/T(rs1917760)變異位點。 通過Western Blot方法檢測MIN-6細胞中的DsbA-L經(jīng)不同糖濃度培養(yǎng)后的蛋白質(zhì)表達變化情況；在MIN-6細胞中過表達DsbA-L蛋白，觀察葡

6、萄糖刺激的胰島素分泌水平。 研究結(jié)果： (1)對DUSP12基因-6735T/C多態(tài)性與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)： 1.糖尿病組與正常糖耐量組間DUSP12基因-6735T/C多態(tài)位點各基因頻率分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；2.在正常糖耐量者中，此多態(tài)C等位基因攜帶者空腹血糖水平高于T/T基因型者[5.00(4.69-5.28)mmol/L VS4.90(4.50-5.26)mmol/L P=0.035]

7、：3.C等位基因攜帶者血清高密度脂蛋白膽固醇低于T/T基因型者(1.25±0.30mmol/L VS1.34±0.30mmol/L P=0.010)。 (2)對DsbA-L基因多態(tài)性與2型糖尿病關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)：1.DsbA-L基因序列在外顯子及側(cè)翼內(nèi)含子區(qū)未見單核苷酸多態(tài)性變異位點；2.位于DsbA-L基因5’非編碼區(qū)的SNP-1308G/T(rs1917760)變異位點多態(tài)性頻率及等位基因頻率分布在正常糖耐量組和糖尿病組間及正常

8、體重和超重/肥胖亞組間均無顯著性差異；2.正常糖耐量及正常體重組中SNP-1308G/T(rs1917760)變異位點T等位基因攜帶者餐后胰島素分泌水平，包括第一相和第二相胰島素分泌，顯著高于非T等位基因攜帶者(P=0.007；P=0.031)。多元逐步回歸分析見到DsbA-L基因SNP-1308G/T(rs1917760)變異位點多態(tài)性在正常糖耐量及正常體重組中是第一相和第二相胰島素分泌的獨立相關(guān)因素(R2=0.055，P=0.007

9、；R2=0.029，P=0.041)；3.在正常糖耐量及超重/肥胖組中SNP-1308G/T(rs1917760)變異位點T等位基因攜帶者的腹內(nèi)脂肪面積顯著高于非T等位基因攜帶者(P=0.020)。 應用小鼠胰島B細胞株MIN-6細胞研究高糖培養(yǎng)對DsbA-L蛋白質(zhì)表達的影響及DsbA-L對胰島素分泌的作用，結(jié)果見到：1.MIN-6細胞中DsbA-L蛋白表達水平隨著培養(yǎng)液中糖濃度的升高呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢，并且在高糖培養(yǎng)下

10、MIN-6細胞中DsbA-L蛋白表達量隨著培養(yǎng)時間的延長亦呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢；2.MIN-6細胞中DsbA-L過表達能增加MIN-6細胞葡萄糖刺激后胰島素分泌水平，在低濃度葡萄糖(3.3mM)刺激時過表達組和對照組胰島素分泌量差異有統(tǒng)計學意義(P=0.013)。 結(jié)論： (1)DUSP12基因SNP-6735T/C(rs1027702)變異位點與2型糖尿病及胰島素抵抗參數(shù)無直接關(guān)聯(lián)，但是與糖脂代謝參數(shù)有一定相關(guān)性