Tenascin-c在椎間盤退行性病變的作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　本研究通過觀察Tenascin-c在椎間盤退行性病變(disc degeneration disease)的表達變化，研究Tenascin-c對椎間盤退行性病變的作用及調節(jié)Tenascin-c的表達是否對椎間盤退行性病變起到保護作用。
　　方法：
　　一、實驗動物及細胞
　　實驗動物為Balb-c小白鼠，雌性，36只，8-12周齡。將36只小白鼠隨機分為兩組，手術組，sham組，每組各18只(n=18

2、)。各組再根據收集樣品的時間點分為三個亞組，即1，3，7天三個時間點，每個時間點6只(n=6)。
　　實驗細胞為人的椎間盤細胞和小鼠的椎間盤細胞，從人和小鼠的椎間盤分離培養(yǎng)。
　　二、實驗方法
　　體外實驗:分離及培養(yǎng)人和小鼠的椎間盤細胞，體外培養(yǎng)至足夠細胞量。使用IL-1β(10ng/ml)給予炎性刺激4小時，8小時，12小時，24小時及48小時，通過RT-PCR來檢測在基因水平上Tenascin-c，Collage

3、nⅡ，Aggrecan的變化，通過western blot來檢測在蛋白水平上Tenascin-c的變化，通過zymography及MMPactivity assay來觀察MMP活性的變化。從而研究Tenascin-c的表達，及與collagenⅡ，aggrecan，MMP表達的關系。
　　加入外源性的Tenascin-c后，給予相同的IL-1β(10ng/ml)炎性刺激，通過RT-PCR來檢測Tenascin-c mRNA水平的變

4、化，觀察與collagenⅡ，aggrecan，MMP表達的關系;通過zymography，來觀察MMP的變化。從而研究加入外源性Tenascin-c后對collagenⅡ，aggrecan，MMP活性表達的影響，從而研究Tenascin-c對椎間盤退行性病是否起到保護作用。
　　體內實驗:sham組:8-12周齡的balb-c雌性小鼠18只，開腹后暴露L2～L8脊柱，之后關腹，縫合。
　　手術組:8-12周齡的balb-c

5、雌性小鼠18只，開腹后暴露L2～L8脊柱，使用27號針頭針刺腰椎間盤L3-L4，關腹縫合。
　　術后于1，3，7天收取各組6只小鼠脊柱樣本，石蠟包埋，做組織切片，做Tenascin-c的免疫組化染色。觀察Tenascin-c的表達情況及表達位置，研究Tenascin-c在體內表達的情況。
　　結果：
　　與對照組相比，IL-1β刺激椎間盤細胞24小時之后，Tenascin-c蛋白水平表達顯著增高(P＜0.05)。

6、>　　與對照組相比，IL-1β刺激不同時間時，Tenascin-c在基因水平上12小時達到峰值(P＜0.05)，24小時開始降低，collagenⅡ，aggrecan在24小時開始降低(P＜0.05)。
　　與對照組相比，IL-1β刺激后，MMP mRNA水平的表達明顯增高(P＜0.05)，且MMP的活性也明顯增高(P＜0.05)。
　　加入外源性Tenascin-c后，給予相同的IL-1β刺激，MMP的活性降低，基因水平上

7、collagenⅡ的表達升高(P＜0.05)，aggrecan無明顯降低，無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　術后1，3，7天的小鼠取脊柱樣本石蠟包埋，做組織切片，同時做sham組與手術組的Tenascin-c的免疫組化染色，手術組Tenascin-c的表達明顯高于sham組，且于第7天表達最多。
　　結論：
　　1、在椎間盤退行性病變時，Tenascin-c表達增高，
　　2、Tenascin-c的表達隨時間而