通過(guò)全外顯子測(cè)序在神經(jīng)退行性病變家系中鑒定出PLA2G6基因的復(fù)合突變.pdf

1、醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)研究的一個(gè)重要領(lǐng)域是探索人類疾病的遺傳變異，從而為疾病的診斷、預(yù)防及其治療提供理論基礎(chǔ)[1]。多種方法已經(jīng)被用于疾病遺傳變異的分析，隨著新一代測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步，特別是2009年，科學(xué)家第一次應(yīng)用全外顯子組測(cè)序技術(shù)(Whole exome sequencing，WES)在4名弗里曼謝爾登綜合征（常染色體顯性遺傳病）中發(fā)現(xiàn)了位于MYH3基因中的點(diǎn)突變，顯示出WES在遺傳病致病基因鑒定中的強(qiáng)大功效。
　　傳統(tǒng)的連鎖分析(Link

2、age analysis)和關(guān)聯(lián)研究(Association study)，已成功鑒定約1/3的遺傳病的致病基因[2]和一些精神分裂癥[3，4]、腫瘤等疾病的易感基因位點(diǎn)。然而對(duì)于家系成員過(guò)少（或不齊全）、致病基因外顯率過(guò)低或位點(diǎn)異質(zhì)性高的孟德?tīng)栠z傳病，連鎖分析的效能則會(huì)明顯減弱[5]。而關(guān)聯(lián)研究揭示的易感位點(diǎn)只能解釋疾病的一小部分遺傳度[6]。此外，隨著易感位點(diǎn)的最小等位基因頻率(Minorallele frequency,MAF)逐

3、漸下降，關(guān)聯(lián)研究達(dá)到足夠檢驗(yàn)效能所需的樣本含量往往呈指數(shù)級(jí)增長(zhǎng)[7]，因此通過(guò)關(guān)聯(lián)研究鑒定得到的位點(diǎn)多為致病效力微弱的常見(jiàn)變異(MAF＞0.05)，而對(duì)低頻變異(MAF＜0.05)和罕見(jiàn)變異(MAF＜0.01)的檢測(cè)能力十分有限[8]。
　　高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)特別是性價(jià)比比較高的全外顯子組測(cè)序(wholeexome sequencing，WES)極大的改善和加速了遺傳病致病基因的挖掘。人類基因組由約3×109個(gè)堿基組成，這包含了

4、編碼區(qū)和非編碼區(qū)，其中約3×108(1％)個(gè)是編碼區(qū)，據(jù)估計(jì)85％的引起疾病的突變都位于基因組的編碼區(qū)及功能區(qū)[9，10]，因此對(duì)基因組的編碼區(qū)（全外顯子組）進(jìn)行測(cè)序可以很好的揭示大量的單基因的稀有的遺傳病及常規(guī)疾病和癌癥中的誘發(fā)性突變。
　　外顯子組測(cè)序基本流程包括外顯子區(qū)域序列的富集、高通量測(cè)序及測(cè)序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析。對(duì)外顯子區(qū)域進(jìn)行富集首先需要將足量復(fù)合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的基因組DNA使用超聲破碎儀打斷成小片段，并與能夠覆蓋外顯子

5、組的探針進(jìn)行雜交，然后洗去未雜交的DNA片段，最后將雜交的DNA片段洗脫下來(lái)，連接接頭(或index)等進(jìn)行PCR擴(kuò)增。高通量測(cè)序是以Illumina公司的Solexa和Hiseq二代測(cè)序技術(shù)為主[11,12]，近兩年來(lái)，LifeTechnologies推出了基于多重PCR的AmpliSeq外顯子捕獲方法，結(jié)合Ion torrent測(cè)序平臺(tái)能顯著縮短實(shí)驗(yàn)周期而逐漸受到研究人員的青睞[13,14]，隨著技術(shù)的快速發(fā)展，市場(chǎng)上還出現(xiàn)了以Pa

6、cBio的SMRT技術(shù)和Oxford的Nanopore技術(shù)為代表的三代測(cè)序技術(shù)[15,16]，極大的改善了測(cè)序的準(zhǔn)確度。生物信息學(xué)分析主要是挖掘變異位點(diǎn)，包括SNP和Indels。首先是通過(guò)質(zhì)控排除測(cè)序中提質(zhì)量的Reads，然后將高質(zhì)量的reads與參考基因組進(jìn)行比對(duì)，統(tǒng)計(jì)SNP和Indels，然后經(jīng)過(guò)一系列公共的突變數(shù)據(jù)庫(kù)如ESP6500，1000Genome等或inhouse數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行已知突變的過(guò)濾，最后對(duì)過(guò)濾后的突變進(jìn)行注釋，然后

7、根據(jù)基因的功能結(jié)合疾病的類型等深入分析，最終確定候選的變異位點(diǎn)。
　　鑒于外顯子測(cè)序技術(shù)已經(jīng)成為鑒定遺傳突變的強(qiáng)有力工具，我們課題組致力于采用這一強(qiáng)有力技術(shù)篩選候選致病位點(diǎn)，并且已經(jīng)在常染色體顯性遺傳的眼球震顫及腰椎滑脫等家系中成功發(fā)現(xiàn)了相關(guān)致病基因[17，18]。在本論文中，我們應(yīng)用WES測(cè)序技術(shù)結(jié)合課題組自己研發(fā)的可以整合分析WES測(cè)序數(shù)據(jù)的MirTrios[19]對(duì)一個(gè)家系進(jìn)行了分析，在患者中發(fā)現(xiàn)了PLA2G6基因的復(fù)合突變

8、，從而正式確診了該病屬于伴隨腦部鐵離子沉積的神經(jīng)退行性病變的一個(gè)亞型:PLA2G6相關(guān)的神經(jīng)退行性病變(PLAN)，而非最初臨床初步診斷的小腦共濟(jì)失調(diào)。
　　目的：
　　通過(guò)對(duì)一個(gè)散發(fā)的伴有運(yùn)動(dòng)功能障礙的患兒及其父母在內(nèi)的的5個(gè)家庭成員進(jìn)行全外顯子組測(cè)序(WES)，經(jīng)過(guò)生物信息學(xué)分析來(lái)挖掘與疾病相關(guān)的新生突變及稀有突變。
　　方法：
　　1.散發(fā)家系成員的募集及外周血的采集
　　2.DNA的提取及全外顯子捕

9、獲測(cè)序
　　3.測(cè)序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析及驗(yàn)證
　　4.候選致病基因的表達(dá)譜分析
　　結(jié)果：
　　1.家系中只有患兒檢查出明顯的臨床表型，主要表現(xiàn)為小腦共濟(jì)失調(diào)、社交言語(yǔ)困難及智力處于中下水平等。
　　2.在所研究的家系中發(fā)現(xiàn)了PLA2G6基因的一個(gè)新生突變c.1634A＞G和一個(gè)稀有突變c.1077G＞A。新生突變c.1634A＞G位于磷脂酶催化域的保守區(qū)，稀有突變c.1077G＞A位于錨蛋白重復(fù)序列上，

10、突變后導(dǎo)致可變剪切的錯(cuò)誤，二個(gè)突變的發(fā)生都可能會(huì)導(dǎo)致蛋白功能的嚴(yán)重受損。
　　3.候選致病基因PLA2G6廣泛表達(dá)于各個(gè)腦區(qū)，隨年齡的變化表達(dá)量比較穩(wěn)定，沒(méi)有大的波動(dòng)。
　　結(jié)論：
　　1.WES和新的生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)異質(zhì)性強(qiáng)的遺傳病的致病突變的尋找是十分有效的。
　　2.本研究鑒定出的PLA2G6的復(fù)合突變很可能導(dǎo)致了該家系中患者的表型。
　　3.本研究鑒定的新的PLA2G6基因相關(guān)致病基因突變擴(kuò)充了PL