P--gp高低表達(dá)MCF7全二維細(xì)胞膜色譜的構(gòu)建與中藥抗乳腺癌成分的篩選研究.pdf

1、乳腺癌(breast cancer,BC)是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，伴隨著較高的致死率，BC的治療引起人們的廣泛關(guān)注。常規(guī)的治療手段有手術(shù)、放療和化療，但是會(huì)引起各種不良反應(yīng)，以及后續(xù)引發(fā)的多藥耐藥現(xiàn)象(multidrug resistance，MDR)，對(duì)患者的身體健康和生活質(zhì)量產(chǎn)生不良影響。中藥治療以其多靶點(diǎn)作用、辨證施治、整體調(diào)理等特點(diǎn)在BC的治療過(guò)程中可以發(fā)揮重要的輔助作用，目前已經(jīng)有一些中藥單體或復(fù)方應(yīng)用于BC臨床治療，但是仍舊主

2、要依賴于廣大醫(yī)生的臨床經(jīng)驗(yàn)，發(fā)揮其抗乳腺癌藥效的機(jī)制仍不清楚。因此，從中藥中快速篩選出其中發(fā)揮藥效的活性成分，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行研究是十分重要的工作。
　　細(xì)胞膜色譜(cell membrane chromatography,CMC)是從上世紀(jì)九十年代開(kāi)始發(fā)展迅速的一種生物親和色譜技術(shù)，以細(xì)胞膜和硅膠載體作為固定相，采用色譜分析的方法，可在體外模擬小分子化合物與細(xì)胞膜受體的相互作用過(guò)程。細(xì)胞膜色譜法將成分分離與活性篩選相結(jié)合，具有操作

3、方便、快速穩(wěn)定，靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于中藥等復(fù)雜成分體系的活性篩選。
　　本課題的主要研究?jī)?nèi)容分為以下三個(gè)部分:
　　1、P-gp高低表達(dá)的MCF7和MCF7/ADR全二維細(xì)胞膜色譜系統(tǒng)的構(gòu)建
　　以MCF7和MCF7/ADR兩株細(xì)胞為研究對(duì)象，用流式細(xì)胞術(shù)和Western Blot方法驗(yàn)證MCF7細(xì)胞膜表面P-gp呈低表達(dá)水平，MCF7/ADR細(xì)胞株呈高表達(dá)水平，且無(wú)藥培養(yǎng)兩周后表達(dá)水平并沒(méi)有發(fā)生顯著變化。搭建了

4、經(jīng)APTES修飾的MCF7和MCF7/ADR-C18柱/TOF-MS全二維細(xì)胞膜色譜系統(tǒng)，同時(shí)構(gòu)建硅膠色譜柱和經(jīng)APTES修飾的硅膠色譜柱全二維分析系統(tǒng)作為參比，進(jìn)行系統(tǒng)的有效性和專屬性考察。系統(tǒng)有效性考察結(jié)果顯示，吉非替尼在硅膠色譜柱和經(jīng)APTES修飾的硅膠色譜柱上沒(méi)有保留行為，但是在MCF7和MCF7/ADR細(xì)胞膜色譜柱上有顯著的保留行為;相應(yīng)的，地塞米松在四種色譜柱上均沒(méi)有表現(xiàn)出任何保留行為，證明該系統(tǒng)有效性良好。系統(tǒng)的專屬性考察

5、結(jié)果顯示，Tariquidar在硅膠色譜柱、經(jīng)APTES修飾的硅膠色譜柱和MCF7細(xì)胞膜色譜柱上沒(méi)有顯著的保留行為，但是MCF7/ADR細(xì)胞膜色譜柱上有顯著的保留行為，顯示該系統(tǒng)有一定的專屬性?？梢杂糜诤Y選中藥中抗乳腺癌潛在活性化合物。
　　2、基于全二維乳腺癌細(xì)胞膜色譜法對(duì)中藥抗乳腺癌活性成分的篩選
　　首先選擇了八種有抗乳腺癌作用的中藥材作為對(duì)象，構(gòu)建其化學(xué)成分庫(kù)，制備了中藥提取液，并用HPLC/TOF-MS系統(tǒng)對(duì)中藥提

6、取液進(jìn)行了分離和分析，并且為后續(xù)的全二維分析提供第二維分離的優(yōu)化條件。應(yīng)用經(jīng)APTES修飾-MCF7/CMC-C18/TOF-MS和經(jīng)APTES修飾-MCF7/ADR/CMC-C18/TOF-MS全二維分析系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對(duì)八種中藥中抗乳腺癌潛在活性成分的篩選，結(jié)果顯示，大黃和黃芩保留成分較多，保留行為較好，因此繼續(xù)以大黃和黃芩為研究對(duì)象，完成了保留成分全二維等高線圖譜的繪制和TOF-MS初步鑒定結(jié)果表，并用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示，大黃提取

7、液在MCF7細(xì)胞膜色譜柱上共有14種保留成分，在MCF7/ADR細(xì)胞膜色譜柱上有15種保留成分，其中在兩株細(xì)胞都有保留的成分有10種，并對(duì)其中食用大黃苷、大黃酚、丹葉大黃素、大黃素甲醚、云杉鞣酚和大黃素六種成分進(jìn)行了驗(yàn)證。黃芩提取液在MCF7細(xì)胞膜色譜柱上共有15種保留成分，在MCF7/ADR細(xì)胞膜色譜柱上有14種保留成分，其中在兩種細(xì)胞膜色譜柱都有保留的成分有10種，并對(duì)其中的漢黃芩素、黃芩苷、千層紙素A、黃芩素和漢黃芩苷五種成分進(jìn)行

8、了驗(yàn)證。為下一步潛在活性成分的藥效驗(yàn)證研究和活性成分與P-gp之間關(guān)系研究奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　3、潛在活性成分抗乳腺癌活性及其與P-gp的關(guān)系研究
　　根據(jù)全二維MCF7和MCF7/ADR細(xì)胞膜色譜系統(tǒng)對(duì)中藥大黃和黃芩的篩選結(jié)果，選擇其中可獲得11個(gè)化合物為對(duì)象。首先對(duì)其潛在抗乳腺癌的作用進(jìn)行體外增殖抑制的藥效驗(yàn)證，結(jié)果顯示，大黃中丹葉大黃素、云杉鞣酚和大黃素，黃芩中漢黃芩素、黃芩苷、千層紙素A和黃芩素對(duì)MCF7和MCF

9、7/ADR兩株細(xì)胞均有一定殺傷作用，且對(duì)兩株的敏感性不同。進(jìn)而采用流式細(xì)胞術(shù)考察它們是否通過(guò)細(xì)胞凋亡這個(gè)途徑發(fā)揮其殺傷作用。結(jié)果顯示，丹葉大黃素、云杉鞣酚、漢黃芩素和黃芩素是通過(guò)凋亡途徑對(duì)MCF7細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用，而其他化合物則不是。丹葉大黃素、漢黃芩素和千層紙素A是通過(guò)凋亡途徑對(duì)MCF7/ADR細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用，而其他化合物則不是。之后，為了研究同一個(gè)化合物對(duì)兩株細(xì)胞殺傷作用的差異是否與P-gp作用相關(guān)，考察了大黃中丹葉大黃素、云杉鞣