低氧抑制MCF-7細(xì)胞中信號素3A表達(dá)并調(diào)控成骨前體細(xì)胞分化的研究.pdf

1、目的：
　　乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在晚期易轉(zhuǎn)移至腦、肝臟、骨骼等器官和系統(tǒng)，患者一旦發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，即宣告了疾病的不可治愈。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移最常見于脊柱，且多為溶骨性骨破壞，造成骨量丟失和病理性骨折，引起患者疼痛、高鈣血癥、癱瘓等一系列并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后和生存質(zhì)量。因此，臨床上急需行之有效的方法來治療和預(yù)防溶骨性骨破壞，與此同時(shí)，明確乳腺癌溶骨性破壞的作用機(jī)制有利于為臨床上新型藥物和治療手段的開發(fā)提供基礎(chǔ)支持。

2、　　信號素3A(semaphorin3A，Sema3A)是神經(jīng)發(fā)育過程中的導(dǎo)向因子之一，隨著對其認(rèn)識的逐漸加深，其在骨代謝領(lǐng)域的研究也有了突破性的進(jìn)展。Sema3A作為一種“骨保護(hù)因子”能夠促進(jìn)成骨前體細(xì)胞分化成熟，增加骨密度;同時(shí)抑制破骨細(xì)胞分化，減少骨吸收作用。雖然Sema3A在生理狀態(tài)下骨代謝中的作用較為明確，但對其病理狀態(tài)下的研究甚少。
　　由于腫瘤轉(zhuǎn)移灶代謝相對活躍，而血管生成速度相對滯后，其微環(huán)境均存在一定程度的缺氧。

3、以往的研究表明，低氧作為腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中的一種危險(xiǎn)因素，能夠加速腫瘤的變異、生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。體外低氧環(huán)境作為上游因素，能通過多種因子調(diào)控腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能。本研究猜想，Sema3A可能作為低氧誘導(dǎo)下的信號分子之一，參與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移骨破壞的調(diào)節(jié)，通過體外低氧刺激乳腺癌MCF-7細(xì)胞，研究常氧與低氧條件下收集MCF-7的細(xì)胞條件培養(yǎng)液對小鼠成骨前體細(xì)胞MC3T3-E1分化能力的影響，并探討Sema3A的表達(dá)對低氧調(diào)控乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中成

4、骨前體細(xì)胞分化的作用與機(jī)制。
　　方法：
　　一、低氧MCF-7條件培養(yǎng)液對成骨前體細(xì)胞分化的影響。
　　1.收集乳腺癌MCF-7細(xì)胞在常氧和低氧條件下培養(yǎng)48h后的條件培養(yǎng)液;
　　2.采用堿性磷酸酯酶(alkaline phosphatase，ALP)活性檢測試劑盒和BCIP/NBT ALP顯色試劑盒檢測MC3T3-E1細(xì)胞中ALP的活性;
　　3.采用茜素紅S(alizarin red S，ARS)染

5、色檢測MC3T3-E1細(xì)胞礦化情況。
　　二、低氧對MCF-7細(xì)胞中Sem a3A表達(dá)的影響。
　　1.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測在常氧和低氧條件下培養(yǎng)0、12、24和48h后乳腺癌MCF-7細(xì)胞中Sema3A的mRNA表達(dá)變化;
　　2.采用蛋白印跡法檢測在常氧和低氧條件下培養(yǎng)0、12、24和48h后乳腺癌MCF-7細(xì)胞中Sema3A的蛋白表達(dá)變化。
　　三、低氧誘導(dǎo)因子對MCF-7細(xì)胞Sema3A表達(dá)的調(diào)控

6、。
　　1.利用shRNA慢病毒構(gòu)建HIF-1α和HIF-2α低表達(dá)的MCF-7細(xì)胞系，并確定干擾效率;
　　2.采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測轉(zhuǎn)染病毒后MCF-7細(xì)胞中Sema3A的mRNA表達(dá)隨時(shí)間的變化;
　　3.采用蛋白印跡法檢測轉(zhuǎn)染病毒后MCF-7細(xì)胞中Sema3A的蛋白表達(dá)隨時(shí)間的變化。
　　四、外源性Sema3A對成骨前體細(xì)胞分化的影響。
　　1.將重組人Sema3A(recombinant h

7、uman semaphorin3A，rhS ema3A)加入到低氧條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞中;
　　2.采用BCIP/NBT ALP顯色試劑盒檢測MC3T3-E1細(xì)胞中ALP的活性;
　　3.采用茜素紅S（alizarin red S，ARS）染色檢測MC3T3-E1細(xì)胞礦化情況。
　　4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測MC3T3-E1細(xì)胞中ALP、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt-related transcr

8、iption factor2，RUNX2)、骨鈣蛋白(osteocalcin，OCN)和轉(zhuǎn)錄因子Osterix(Osx)的mRNA表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　一、低氧MCF-7條件培養(yǎng)液對成骨前體細(xì)胞分化的影響。
　　1.相比于常氧條件下獲得的MCF-7條件培養(yǎng)液(NorCM)組，低氧條件培養(yǎng)的MCF-7條件培養(yǎng)液(HyCM)組可以使MC3T3-E1細(xì)胞的ALP活性明顯減弱(P＜0.05);
　　2.ARS染色顯

9、示，HyCM組比NorCM組鈣化面積明顯減小(P＜0.05)。
　　二、低氧對MCF-7細(xì)胞中Sema3A表達(dá)的影響。
　　低氧條件下處理MCF-7細(xì)胞24h和48h后，細(xì)胞中Sema3A的mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯低于常氧條件下相同時(shí)間點(diǎn)的Sema3A表達(dá)水平（P值均＜0.05）。
　　三、低氧誘導(dǎo)因子對乳腺癌細(xì)胞Sema3A表達(dá)的調(diào)控。
　　1.HIF-1α和HIF-2αshRNA可分別有效干擾乳腺癌MCF

10、-7細(xì)胞HIF-1α和HIF-2α的表達(dá)（P值均＜0.05）;
　　2.干擾HIF-1α表達(dá)后，MCF-7細(xì)胞Sema3A的mRNA和蛋白表達(dá)在低氧誘導(dǎo)下與常氧誘導(dǎo)相比無明顯變化;
　　3.干擾HIF-2α表達(dá)后，在低氧誘導(dǎo)下12、24和48h的MCF-7細(xì)胞中Sema3A的mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯低于常氧條件下相同時(shí)間點(diǎn)的Sema3A表達(dá)水平(P值均＜0.05)。
　　四、外源性Sema3A對成骨前體細(xì)胞分化的影

11、響。
　　1.相比于HyCM組，HyCM+S ema3A組MC3T3-E1細(xì)胞的ALP活性及ARS染色明顯增強(qiáng)（P值均＜0.05）;
　　2.加入rhSema3A的HyCM組，其分化早期（RUNX2、ALP）和分化晚期(OCN、Osx)的mRNA表達(dá)較HyCM組之前的表達(dá)明顯升高（P值均＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.低氧MCF-7條件培養(yǎng)液比常氧MCF-7條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)成骨前體細(xì)胞分化能力顯著降低;