山萘酚磺化衍生物體內外抗氧化活性研究.pdf

1、自由基與疾病之間的關系已經(jīng)成為現(xiàn)代醫(yī)學與生命科學領域的一大熱點。自由基是機體在代謝過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物，許多疾病的發(fā)生都與自由基的氧化破壞有關。當機體組織或細胞內氧自由基增加和（或）清除能力降低，導致活性氧家族在組織或細胞內蓄積而引起的氧化損傷過程稱為氧化應激(oxidativestress)。氧化應激可以引起DNA氧化損傷和蛋白質的表達異常，使人或動物機體處于易損狀態(tài)，從而誘發(fā)多種疾病。因此有效的清除機體內多余的自由基不僅有利于人或動

2、物正常的生理活動，同時可以防止疾病的發(fā)生。
　　清除機體內多余的自由基主要是靠內源性自由基清除系統(tǒng)，可分為非酶促系統(tǒng)和酶促系統(tǒng)兩類，兩類清除系統(tǒng)相互協(xié)同共同完成體內的抗氧化任務。非酶促系統(tǒng)主要包括維生素（VA、 VC、 VE等）、微量元素Se、金屬結合蛋白和各類具有抗氧化作用的化合物等;酶促系統(tǒng)主要包括SOD、GSH-Px、CAT等。要降低自由基對機體的傷害，除了依靠內源性自由基清除系統(tǒng)外，還需要尋找和發(fā)掘外源性的自由基清除劑，從

3、而使機體免受自由基的傷害。近年來，許多從中草藥或植物中提取的多糖、黃酮等天然活性成分由于可以促進機體內抗氧化酶系的生成、提高機體內活性氧自由基的清除能力并且毒副作用較低而受到廣泛關注。
　　山萘酚(Kaempferol)屬于天然黃酮醇類化合物，廣泛存在于水果、蔬菜、豆類、茶葉以及許多中草藥如沙棘、銀杏葉等植物中。山萘酚具有抗氧化、抗腫瘤、抗?jié)?、抗炎、抗動脈粥樣硬化、降低血脂及膽固醇、利膽利尿、止咳等多種藥理活性。然而，山萘酚雖有

4、如此多的生物活性，但其親水性差，因此限制了山萘酚在臨床上的應用。到目前為止，以山萘酚為先導化合物進行結構修飾從而改善親水性、提高藥理活性的文獻鮮有報道。
　　磺化反應是藥物合成中的一類重要反應，其特點是操作簡單，反應快速，合成效率高。藥物分子中引入磺酸基(—SO3H)后，不僅會增加藥物水溶性，同時能保持或提高它們原有的藥理活性，而且磺酸基中的硫原子也具有良好的抗病毒活性。因此本文的研究內容主要包括以下幾個方面:
　　1.以天

5、然產(chǎn)物山萘酚(Kae)為原料，通過磺化反應得到山萘酚的磺化衍生物(KS)，通過紅外、核磁共振譜、元素分析、高分辨質譜等手段確定了組成和結構，分子式為[C15H9O9SNa·2.5 H2O]，化學名稱為3，5，7,4'-四羥基黃酮-3'-磺酸鈉，該物質易溶于水。
　　2.采用DPPH法、ABTS法、Fenton反應等化學體系法比較研究Kae與KS體外清除自由基的能力，實驗結果表明，Kae與KS均有一定的清除自由基能力，并且在相同濃度

6、下KS的清除能力比山萘酚強。
　　3.采用CCK-8法分別研究不同劑量的Kae與KS對H2O2誘導損傷人血管平滑肌細胞(VSMC)活力的影響，設置正常空白組，H2O2氧化損傷組，Kae不同濃度陽性對照組(5、10、20μmol/L)，KS不同濃度實驗組(5、10、20μmol/L)，實驗結果表明，H2O2損傷組和正常空白組相比，細胞活力下降至44.43％，Kae不同濃度陽性對照組的細胞活力與H2O2損傷組細胞活力相差不大，而KS實

7、驗組對H2O2誘導的VSMC損傷則有明顯的保護作用，且存在劑量依賴性，當KS濃度為20μmol/L，保護作用最強，其細胞活力和正?？瞻捉M相當。
　　4.采用AnnexinⅤ/PI雙染流式細胞術檢測上述各組細胞的凋亡率，實驗結果表明，空白對照組的VSMC凋亡較少，僅占15.41％，而H2O2損傷組凋亡率明顯增加，高達48.42％，而用不同濃度KS與H2O2一起孵育24h后，不同濃度KS實驗組細胞凋亡率與H2O2氧化損傷組相比，凋亡率

8、明顯降低，并呈一定的劑量依賴性，分別為:27.08％，26.48％，22.06％;同時，采用Western Blot檢測各組細胞裂解液中與凋亡相關的促凋亡蛋白Caspase3、BAD和抗凋亡蛋白Bcl-2相對表達影響，實驗結果表明KS可以明顯降低促凋亡蛋白Caspase-3、BAD蛋白的相對表達量，增加Bcl-2的相對表達量從而起到保護H2O2誘導VSMC凋亡的作用。
　　5.采用ELISA法系統(tǒng)研究不同劑量KS對H2O2誘導損傷

9、血管平滑肌細胞超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、乳酸脫氫酶(LDH)的活力以及丙二醛(MDA)含量的影響。設置空白組、H2O2損傷模型組、KS實驗組(5、10、20μM)，實驗結果顯示H2O2誘導VSMC損傷后，細胞裂解液中的SOD、GSH-Px等抗氧化酶的活性降低，同時LDH活性和MDA的含量明顯增加，加入不同濃度的KS后，和H2O2組相比，KS可劑量依賴性的抑制上述效應。
　　6.體外抗氧化活性實驗

10、結果表明KS具有良好的抗氧化活性，在此基礎上，本論文對KS能否改善機體內抗氧酶體系也做了初步研究。設置空白組，KS高劑量組(64mg/kg·d)、中劑量組(32mg/kg·d)、低(16mg/kg·d)劑量組，對無特定病原菌的小白鼠連續(xù)灌服KS水溶液15天，取肝、腎組織分別制備成10％的組織勻漿液測定其MDA含量，SOD、GSH-Px、CAT活力及T-AOC變化，實驗結果顯示:小鼠肝臟、腎臟中的SOD、GSH-Px、CAT活力及T-AO