7-氮雜異靛藍(lán)衍生物體內(nèi)外抗腫瘤作用及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡機(jī)理研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)的研究目的是從新合成的一系列7-氮雜靛玉紅類衍生物中篩選出能夠有效抑制腫瘤細(xì)胞增殖的化合物，探討其可能的作用機(jī)制，為研發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的靛玉紅類抗腫瘤新藥打下基礎(chǔ)。
　　 MTT法從9種化合物中篩選出4種溶解性較好的化合物。4種化合物以不同濃度作用于HepG2，Hela，A549，Eca109四種腫瘤細(xì)胞株48 h，MTT法檢測(cè)化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的影響，計(jì)算其IC50值；選取6號(hào)化合物(7-AI-b)進(jìn)行抗腫瘤機(jī)制研究

2、。活細(xì)胞工作站觀察細(xì)胞形態(tài)的變化；Hoechst33342染色觀察細(xì)胞核的變化；Annexin-V/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；Western印記檢測(cè)細(xì)胞色素C(Cyto C)的轉(zhuǎn)位和caspase-3蛋白的活化；DCFH-DA染色檢測(cè)活性氧(ROS)生成；JC-1染色檢測(cè)線粒體膜電位；熒光素酶法檢測(cè)ATP含量；Fluo-3染色檢測(cè)胞內(nèi)鈣離子含量；PI染色分析細(xì)胞周期。MDC染色觀察自噬小泡的形成；Western blot檢測(cè)自噬通路相關(guān)蛋

3、白LC3的蛋白表達(dá)；用Heps肝癌荷瘤小鼠模型，評(píng)價(jià)7-AI-b的在體抗腫瘤作用。
　　 結(jié)果顯示，通過MTT檢測(cè)和相差顯微鏡觀察7-AI-b以時(shí)間和劑量依賴性方式抑制A549細(xì)胞的增殖。化合物分別以4個(gè)濃度梯度作用于四種腫瘤細(xì)胞株，計(jì)筍其IC50值在28-40μmol/L左右。7-AI-b體外作用于A549細(xì)胞，細(xì)胞核明顯發(fā)生改變，凋亡的細(xì)胞數(shù)顯著的增加。Western blot結(jié)果表明，轉(zhuǎn)位至胞漿中的Cyto C逐漸升高，c

4、aspase-3發(fā)生了活化，說明7-AI-b誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生了線粒體介導(dǎo)的凋亡。另外，7-AI-b可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加，細(xì)胞內(nèi)鈣離子超載，線粒體膜電位和ATP含量降低。與傳統(tǒng)靛玉紅一樣，7-AI-b可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞G0/G1期阻滯。另外，7-AI-b可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明ROS可能是7-AI-b引起腫瘤細(xì)胞凋亡和自噬的原因。在體內(nèi)7-AI-b對(duì)Heps肝癌的抑制作用與5-Fu相近，而7-AI-b對(duì)于小鼠的毒