登革病毒全基因序列的時空特點和登革熱以及重癥登革的病原學診斷、臨床特點和預后預測分析.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分我國大陸登革病毒全基因的時空分析
　　研究方法:
　　從NCBI的GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中下載我國大陸1978年至2011年登革病毒全長基因序列，并同時下載國際公認標準株序列，即:登革病毒Ⅰ型夏威夷株（DENV-1，Hawaii株）、登革病毒Ⅱ型新幾內亞株(DENV-2，New guinea-C株)、登革病

2、毒Ⅲ型H87株（DENV-3，H-87株）和登革病毒Ⅳ型H241株（DENV-4，H241株）。將DENV-1和DENV-2病毒的基因序列裝載到Mega5.05軟件中進行多序列比對，比對完成后構建系統(tǒng)進化樹和基因的遺傳進化距離。
　　對四種血清型的氨基酸變異分析，使用統(tǒng)計軟件SPSS13.0軟件。計量資料采用均數(shù)±標準差((x)±S)。對于符合參數(shù)檢驗的多組之間采用One-Way ANOVA（檢驗統(tǒng)計量:F），兩組間采用Stude

3、nt-t Test（檢驗統(tǒng)計量:t）;對于不符合參數(shù)檢驗的多組之間采用非參數(shù)檢驗:Kruskal-Wallis檢驗（檢驗統(tǒng)計量:x2）、Mann-Whitney U檢驗（檢驗統(tǒng)計量:Z），取雙側P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。
　　研究結果:
　　1.共納入分析登革病毒40株，其中DENV-1為19株，DENV-2為11株，DENV-3為6株，DENV-4為4株。DENV-1和DENV-2的14個基因區(qū)域與全基因構建的進化樹不完

4、全相似，并且各個基因的遺傳進化距離變異較大。
　　2.根據(jù)登革病毒的四種血清型分為四組:DENV-1氨基酸突變個數(shù)為85.211±13.252個;DENV-2為72.727±21.448個;DENV-3為59.167±22.649個;DENV-4為82±18.129個。統(tǒng)計分析結果顯示四種血清型的登革病毒之間的氨基酸變異個數(shù)具有顯著性統(tǒng)計學差異(F=5.661，p=0.003)，進一步的多重比較選LSD法，DENV-1與DENV-

5、2和DENV-3氨基酸變異數(shù)存在顯著性差異(p=0.002和p=0.003)，其余組之間無顯著性差異，說明DENV-1的氨基酸變異個數(shù)最多。
　　3.根據(jù)登革病毒的分離時間和血清型分為四組:1991年至2000年的DENV-1，共5株，開放閱讀框的氨基酸變異個數(shù)82±6.7個;2001年至2010年的DENV-1，共12株，氨基酸變異個數(shù)為89.2±14.2個;1991年至2000年的DENV-2，共4株，氨基酸變異個數(shù)為74.8

6、±7.8個;2001年至2010年的DENV-2，共4株，氨基酸變異個數(shù)為70.0±5.7個。統(tǒng)計分析結果顯示四組之間的氨基酸變異個數(shù)具有顯著性統(tǒng)計學差異(F=3.671，p=0.029);進一步研究發(fā)現(xiàn)以2000年以后流行的DENV-1和DENV-2病毒株的E基因區(qū)域（非參數(shù)檢驗-Mann-Whitney U法）和NS1基因區(qū)域（參數(shù)檢驗:Students-t法）的氨基酸變異個數(shù)存在顯著性統(tǒng)計學差異（E基因區(qū)域:Z=2.961，p=0

7、.003; NS1基因區(qū)域:t=4.896，p＜0.001）。
　　4.進一步分析發(fā)現(xiàn)在DENV-1病毒株的E基因區(qū)域出現(xiàn)N290D、L402F和A473T的突變，在NS1區(qū)域中出現(xiàn)R101K、G105R、D340E和L349M的突變，而這些突變位點在DENV-2病毒株中未出現(xiàn)。
　　5.根據(jù)登革病毒流行的地點分為兩組:流行于廣州地區(qū)的DENV-1共14株，NS3的氨基酸變異個數(shù)為12.1±2.0個;非廣州地區(qū)的DENV-1

8、共5株，NS3基因區(qū)域的氨基酸變異個數(shù)為9.8±1.8個。流行于廣州地區(qū)的DENV-1病毒株，其NS3區(qū)氨基酸變異數(shù)高于非廣州地區(qū)，差異有統(tǒng)計學顯著性意義(t=2.3，p=0.034);廣州地區(qū)的DENV-2共4株，NS3基因區(qū)域的氨基酸變異個數(shù)為12.8±1.5個，非廣州地區(qū)的DENV-2共7株，NS3基因區(qū)域的氨基酸變異個數(shù)為8.4±4.5個，流行于廣州地區(qū)的DENV-2病毒株，其NS3區(qū)的氨基酸變異數(shù)高于非廣州地區(qū)，差異有統(tǒng)計學顯

9、著性意義(Z=2.2，p=0.042)。
　　第二部分NS1蛋白捕獲法診斷登革熱的系統(tǒng)評價
　　研究方法:
　　制定文獻納入標準，需要實驗室確診為登革病毒感染，以下三種方法之一，即病毒的分離和鑒定、病毒RNA檢測和IgM和/或IgG血清學轉換的血清學的檢測，同時報道有NS1檢測結果;納入研究的登革病毒感染人群和對照人群的樣本量，每組至少50例。檢索數(shù)據(jù)庫NCBI PubMed、ISI Web of Science、Go

10、ogle學術和中國學術期刊全文數(shù)據(jù)庫(the Chinese National Knowledge Infrastructuredatabases，CNKI)，檢索的時間設定均從建庫到2012年10月。檢索詞以“dengue”、“NS1”或“non-structure1”、“diagnosis”主題詞進行布爾邏輯搭配檢索。提取數(shù)據(jù)，評價納入研究的文獻質量，并使用STATA11.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。
　　研究結果:
　　共納入

11、18篇觀察性研究，12313患者。單用NS1檢測法，分為兩種，即酶聯(lián)免疫吸附法和免疫層析法。登革熱病毒血清分型:DENV-1為50％-90.9％之間，DENV-2為38.5-85.7％，DENV-3為46.7-91.3％和DENV-4為21.7-87％。
　　第三部分臨床癥狀和體征預測重癥登革熱的系統(tǒng)評價
　　研究方法:
　　制定文獻納入標準，符合登革熱診斷標準，不限納入研究的類型，可以是觀察性研究，明確將患者分為登革

12、熱和重癥登革熱（登革出血熱或登革休克綜合征），并能分別獲得各組患者臨床癥狀和體征的信息。
　　研究結果:
　　16篇研究納入分析，共納入分析11個因素，分別為:性別、惡心/嘔吐、出血（牙齦出血、鼻出血、嘔血和黑便）、頭痛、腹痛、眶后痛、皮疹、腹瀉、肝腫大、乏力和束臂試驗。
　　第四部分2014年廣東省212例登革熱的臨床特征分析
　　研究方法:
　　納入2014年6月至10月在南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院和廣州市第

13、八人民醫(yī)院住院的登革熱患者回顧性分析，入選標準患者符合2009年WHO發(fā)布的登革熱診療指南的診斷標準。
　　采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，對于符合參數(shù)檢驗的計量資料采用均數(shù)±標準差(x±S)表示，組間比較采用t檢驗(Student's t test);不符合參數(shù)檢驗的計量資料采用中位數(shù)和極大值、極小值表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗（Kruskal-Wallis test）。采用MedCalc軟件繪制受試者工作特征曲線(Rec

14、eiverOperating Characteristic Curve，ROC曲線），并統(tǒng)計ROC曲線下面積(Area Underthe ROC，AUC)，以及臨界值。二分類的Logistic回歸用于分析預測重癥登革熱的因素。P值取雙側，且P＜0.05有統(tǒng)計學意義。
　　研究結果:
　　共納入212例住院患者，平均年齡為40.6±16.0歲，男性102例，女性110例，登革熱組患者為174例，重癥登革熱組患者38例。兩組患者

15、在性別上存在顯著性差異(p=0.003)，重癥登革熱患者女性較多。兩組患者的臨床表現(xiàn)中，重癥登革熱患者中出現(xiàn)意識障礙、嗜睡、黃疸、胸腔積液、腹水、HCT升高超過20％伴血小板快速降低和陰道出血顯著高于登革熱患者（p均小于0.05）。血液學參數(shù)結果提示重癥登革熱患者的丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、草氨酸氨基轉移酶(AST)、白細胞計數(shù)(WBC)、活化部分凝血酶原時間(APTT)和凝血酶原時間(PT)顯著性高于登革熱患者（p均小于0.05），

16、而白蛋白(ALB)和PLT計數(shù)(PLT)則均顯著性低于登革熱患者。AST和ALB對診斷重癥登革熱的價值較低(ROC曲線下面積在0.5-0.7之間)，ALT、WBC和APTT診斷重癥登革熱的價值也較低（雖然ROC曲線下面積在0.7-0.9之間，但是95％置信區(qū)間包含有0.5），PLT和PT對重癥登革熱的診斷，其準確性中等。
　　結論:
　　1.2000年以后主要為DENV-1的流行，E基因和NS1基因區(qū)域的氨基酸突變可能是原因

17、之一;而不同區(qū)域的DENV-1和DENV-2的流行程度可能與NS3基因區(qū)域的氨基酸突變有關。
　　2.單用NS1檢測法可以用來確診登革病毒的感染，NS1聯(lián)合IgM檢測法可以用來監(jiān)測登革熱。NS1檢測法可以鑒別出DENV-1和DENV-3。此外，商用Dengue NS1 Ag STRIP試劑是診斷和病毒血清分型的最佳試劑。
　　3.登革熱患者存在惡心/嘔吐、持續(xù)腹痛、皮疹、明顯出血傾向和肝腫大的登革熱患者更易進展為重癥登革熱，