過表達膽綠素還原酶的巨噬細胞對小鼠缺血再灌注誘導急性腎臟損傷后纖維化的影響.pdf

1、第一部分、研究膽綠素還原酶與巨噬細胞的關(guān)系
　　目的：探討巨噬細胞分化模型中BVR的表達，腎臟缺血再灌注模型中BVR陽性的巨噬細胞的表達情況。
　　方法：體外培養(yǎng)L929細胞三天，收集L929細胞上清，用此培養(yǎng)基來體外培養(yǎng)小鼠骨髓來源巨噬細胞7天，分別用LPS100ng/ml和IFN-γ100ng/ml、IL-410ng/ml和IL-1310ng/ml刺激24小時后收集細胞。用Western blot檢測INOS和ARG-1

2、的表達；用流式細胞術(shù)檢測CD45、F4/80、CD11b、CD86和DECTIN-1的表達；用RT-PCR檢測INOS、ARG-1、TNF-α、FIZZ1、YM-1、MMR和TGF-β的表達來判斷M1和M2的模型是否建立成功，然后在巨噬細胞模型中檢測BVR的表達。同時在RAW264.7細胞系構(gòu)建的巨噬細胞分化模型中檢測BVR的表達。并在腎臟缺血再灌注手術(shù)5天和10天后用流式細胞術(shù)檢測血液、骨髓和腎臟中BVR陽性的巨噬細胞表達的情況。

3、r>　　結(jié)果：⑴Western blot發(fā)現(xiàn)LPS和IFN-γ組（M1巨噬細胞）INOS表達增加，IL-4和IL-13組（M2巨噬細胞）ARG-1表達增加；⑵流式細胞術(shù)發(fā)現(xiàn)LPS和IFN-γ組巨噬細胞中CD86表達增加，IL-4和IL-13組巨噬細胞中DECTIN-1表達增加；⑶RT-PCR發(fā)現(xiàn)LPS和 IFN-γ組巨噬細胞中INOS和TNF-α表達增加；IL-4和IL-13組巨噬細胞中ARG-1、YM-1、FIZZ1、MMR和TGF-

4、β表達增加；⑷RT-PCR發(fā)現(xiàn)在小鼠骨髓來源的巨噬細胞和RAW264.7細胞系巨噬細胞分化模型中BVR均在M1表達降低，在M2中表達增加；⑸在缺血再灌注手術(shù)5天和10天后，BVR陽性的巨噬細胞在血液、骨髓和腎臟中表達都較對照組增加。
　　結(jié)論：⑴LPS和IFN-γ，IL-4和IL-13刺激小鼠骨髓來源巨噬細胞構(gòu)建M1和M2模型成功；⑵BVR在小鼠骨髓來源巨噬細胞和小鼠單核巨噬細胞系構(gòu)建的巨噬細胞分化模型中均在M1中表達降低，在M2

5、中表達增加；⑶BVR陽性的巨噬細胞在血液、骨髓和腎臟中均廣泛存在。
　　第二部分、過表達膽綠素還原酶的巨噬細胞對急性腎損傷后腎臟
　　目的：通過重度腎臟缺血再灌注損傷建立急性腎損傷后腎臟纖維化，探討過表達BVR巨噬細胞在急性腎損傷后腎臟纖維化中的作用。
　　方法：將6周大小的C57BL/6雄性小鼠分為假手術(shù)組、手術(shù)組、注射過表達BVR細胞手術(shù)組和注射腺病毒陰性對照手術(shù)組。應用FHC溫控系統(tǒng)建立重度腎臟缺血再灌注模型。在

6、37℃條件下，假手術(shù)組開腹30分鐘；手術(shù)組夾閉左側(cè)腎臟30分鐘，右側(cè)腎臟不處理，術(shù)后一天通過尾靜脈注射過表達BVR的巨噬細胞或?qū)φ障俨《揪奘杉毎?06/只），注射細胞5天后取標本，用PAS染色觀察形態(tài)學變化，Masson和天狼星紅染色觀察纖維化情況，組化檢測α-SMA、collagenIV和PDGFR-β，Western blot檢測α-SMA、PDGFR-β和Vimentin。
　　結(jié)果：注射細胞后1天取小鼠血液和左右腎臟標本

7、，流式細胞術(shù)檢測GFP表達，發(fā)現(xiàn)GFP陽性巨噬細胞在手術(shù)側(cè)腎臟明顯增加（16.47％±3.66%），血液中也有少量GFP陽性巨噬細胞（2.48%±2.54%）。注射細胞5天后病理檢測發(fā)現(xiàn)，小鼠管腔擴大管壁變薄，腎間質(zhì)炎性細胞浸潤，腎小管上皮細胞的脫落壞死在注射過表達BVR巨噬細胞組最為明顯；組化結(jié)果顯示腎臟α-SMA、collagenIV和PDGFR-β表達在過表達BVR巨噬細胞注射組表達最多；Western blot結(jié)果顯示α-SMA

8、、PDGFR-β和Vimentin在過表達BVR巨噬細胞注射組表達升高。
　　結(jié)論：⑴注射GFP陽性巨噬細胞后細胞主要存在于缺血再灌注模型的手術(shù)側(cè)腎臟；⑵注射過表達BVR巨噬細胞腎臟纖維化和腎臟損傷與腺病毒陰性對照細胞注射相比有所加重。
　　第三部分、過表達膽綠素還原酶巨噬細胞對敲除巨噬細胞后急性腎損傷腎臟纖維化的影響
　　目的：通過脂質(zhì)體敲除巨噬細胞和重度腎臟缺血再灌注損傷建立巨噬細胞敲除急性腎損傷后腎臟纖維化，探討

9、過表達BVR巨噬細胞在巨噬細胞敲除后腎臟纖維化中的作用。
　　方法：將6周大小的C57BL/6雄性小鼠分為假手術(shù)組、敲除巨噬細胞手術(shù)組、注射過表達BVR細胞敲除巨噬細胞手術(shù)組和注射腺病毒陰性對照手術(shù)組。通過尾靜脈注射clodronate liposomes200μl兩天后，應用FHC溫控系統(tǒng)建立重度腎臟缺血再灌注模型。在37℃條件下，假手術(shù)組開腹30分鐘；手術(shù)組夾閉左側(cè)腎臟30分鐘，右側(cè)腎臟不處理，術(shù)后一天通過尾靜脈注射過表達BV

10、R的巨噬細胞或?qū)φ障俨《揪奘杉毎?06/只），注射細胞5天后取標本，用PAS染色觀察形態(tài)學變化，Masson和天狼星紅染色觀察纖維化情況，組化檢測α-SMA、collagenIV和PDGFR-β，Western blot檢測α-SMA、PDGFR-β和Vimentin，RT-PCR檢測COL1α1和Kim-1。
　　結(jié)果：注射細胞5天后病理檢測發(fā)現(xiàn)，小鼠管腔擴大管壁變薄，腎間質(zhì)炎性細胞浸潤，腎小管上皮細胞的脫落壞死在注射過表達B

11、VR細胞敲除巨噬細胞手術(shù)組最為明顯；組化結(jié)果顯示腎臟α-SMA、collagenIV和PDGFR-β表達在過表達BVR細胞敲除巨噬細胞手術(shù)組表達最多；Western blot結(jié)果顯示α-SMA、PDGFR-β和Vimentin在過表達BVR細胞敲除巨噬細胞手術(shù)組表達升高。RT-PCR結(jié)果顯示COL1α1和Kim-1在過表達BVR細胞敲除巨噬細胞手術(shù)組表達升高。
　　結(jié)論：注射過表達BVR巨噬細胞腎臟纖維化和腎臟損傷與腺病毒陰性對照

12、細胞注射相比有所加重。
　　第四部分、過表達膽綠素還原酶巨噬細胞的功能
　　目的：探討過表達BVR小鼠巨噬細胞的功能。
　　方法：分離培養(yǎng)原代小鼠骨髓來源的巨噬細胞和小鼠巨噬細胞系RAW264.7，腺病毒包裝的BVR基因轉(zhuǎn)染骨髓來源的巨噬細胞，Western blot和RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率，然后用RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后細胞INOS、ARG-1、TNF-α和IL-6的表達水平。分別給予GM-CSF100ng/ml和5

13、0ng/ml、M-CSF100ng/ml和50ng/ml刺激小鼠骨髓來源的巨噬細胞24小時，RT-PCR檢測BVR表達，根據(jù)BVR表達情況確定GM-CSF和M-CSF刺激濃度。細胞轉(zhuǎn)染之后分別給予LPS1μg/ml、100ng/ml、GM-CSF100ng/ml和M-CSF100ng/ml刺激過表達BVR巨噬細胞24小時，用RT-PCR檢測細胞INOS、ARG-1、TNF-α和IL-6的表達水平。
　　結(jié)果：在小鼠骨髓來源巨噬細胞

14、和小鼠巨噬細胞系RAW264.7中均發(fā)現(xiàn)BVR過表達組巨噬細胞INOS、ARG-1、TNF-α和IL-6表達增加；同時經(jīng)過LPS1μg/ml和100ng/ml刺激24小時后，BVR過表達組巨噬細胞INOS、TNF-α和IL-6表達增加更加明顯，在LPS1μg/ml組更加明顯；經(jīng)GM-CSF100ng/ml、50ng/ml、M-CSF100ng/ml和50ng/ml分別刺激小鼠骨髓來源巨噬細胞24小時后，RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn) BVR在GM

15、-CSF100ng/ml組降低最明顯，而在M-CSF100ng/ml組升高最明顯，故選用100ng/ml濃度刺激過表達BVR巨噬細胞，GM-CSF刺激過表達BVR的巨噬細胞促進INOS、TNF-α和IL-6表達增加，而M-CSF刺激BVR過表達巨噬細胞卻沒有這個作用。
　　結(jié)論：⑴過表達BVR巨噬細胞INOS、TNF-α和IL-6表達增加，LPS刺激過表達BVR的巨噬細胞促進INOS、TNF-α和IL-6表達；⑵GM-CSF使過表