過表達(dá)膽綠素還原酶的巨噬細(xì)胞對小鼠缺血再灌注誘導(dǎo)急性腎臟損傷后纖維化的影響.pdf

1、第一部分、研究膽綠素還原酶與巨噬細(xì)胞的關(guān)系
　　目的：探討巨噬細(xì)胞分化模型中BVR的表達(dá)，腎臟缺血再灌注模型中BVR陽性的巨噬細(xì)胞的表達(dá)情況。
　　方法：體外培養(yǎng)L929細(xì)胞三天，收集L929細(xì)胞上清，用此培養(yǎng)基來體外培養(yǎng)小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞7天，分別用LPS100ng/ml和IFN-γ100ng/ml、IL-410ng/ml和IL-1310ng/ml刺激24小時(shí)后收集細(xì)胞。用Western blot檢測INOS和ARG-1

2、的表達(dá)；用流式細(xì)胞術(shù)檢測CD45、F4/80、CD11b、CD86和DECTIN-1的表達(dá)；用RT-PCR檢測INOS、ARG-1、TNF-α、FIZZ1、YM-1、MMR和TGF-β的表達(dá)來判斷M1和M2的模型是否建立成功，然后在巨噬細(xì)胞模型中檢測BVR的表達(dá)。同時(shí)在RAW264.7細(xì)胞系構(gòu)建的巨噬細(xì)胞分化模型中檢測BVR的表達(dá)。并在腎臟缺血再灌注手術(shù)5天和10天后用流式細(xì)胞術(shù)檢測血液、骨髓和腎臟中BVR陽性的巨噬細(xì)胞表達(dá)的情況。

3、r>　　結(jié)果：⑴Western blot發(fā)現(xiàn)LPS和IFN-γ組（M1巨噬細(xì)胞）INOS表達(dá)增加，IL-4和IL-13組（M2巨噬細(xì)胞）ARG-1表達(dá)增加；⑵流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)LPS和IFN-γ組巨噬細(xì)胞中CD86表達(dá)增加，IL-4和IL-13組巨噬細(xì)胞中DECTIN-1表達(dá)增加；⑶RT-PCR發(fā)現(xiàn)LPS和 IFN-γ組巨噬細(xì)胞中INOS和TNF-α表達(dá)增加；IL-4和IL-13組巨噬細(xì)胞中ARG-1、YM-1、FIZZ1、MMR和TGF-

4、β表達(dá)增加；⑷RT-PCR發(fā)現(xiàn)在小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞和RAW264.7細(xì)胞系巨噬細(xì)胞分化模型中BVR均在M1表達(dá)降低，在M2中表達(dá)增加；⑸在缺血再灌注手術(shù)5天和10天后，BVR陽性的巨噬細(xì)胞在血液、骨髓和腎臟中表達(dá)都較對照組增加。
　　結(jié)論：⑴LPS和IFN-γ，IL-4和IL-13刺激小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞構(gòu)建M1和M2模型成功；⑵BVR在小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞和小鼠單核巨噬細(xì)胞系構(gòu)建的巨噬細(xì)胞分化模型中均在M1中表達(dá)降低，在M2

5、中表達(dá)增加；⑶BVR陽性的巨噬細(xì)胞在血液、骨髓和腎臟中均廣泛存在。
　　第二部分、過表達(dá)膽綠素還原酶的巨噬細(xì)胞對急性腎損傷后腎臟
　　目的：通過重度腎臟缺血再灌注損傷建立急性腎損傷后腎臟纖維化，探討過表達(dá)BVR巨噬細(xì)胞在急性腎損傷后腎臟纖維化中的作用。
　　方法：將6周大小的C57BL/6雄性小鼠分為假手術(shù)組、手術(shù)組、注射過表達(dá)BVR細(xì)胞手術(shù)組和注射腺病毒陰性對照手術(shù)組。應(yīng)用FHC溫控系統(tǒng)建立重度腎臟缺血再灌注模型。在

6、37℃條件下，假手術(shù)組開腹30分鐘；手術(shù)組夾閉左側(cè)腎臟30分鐘，右側(cè)腎臟不處理，術(shù)后一天通過尾靜脈注射過表達(dá)BVR的巨噬細(xì)胞或?qū)φ障俨《揪奘杉?xì)胞（106/只），注射細(xì)胞5天后取標(biāo)本，用PAS染色觀察形態(tài)學(xué)變化，Masson和天狼星紅染色觀察纖維化情況，組化檢測α-SMA、collagenIV和PDGFR-β，Western blot檢測α-SMA、PDGFR-β和Vimentin。
　　結(jié)果：注射細(xì)胞后1天取小鼠血液和左右腎臟標(biāo)本

7、，流式細(xì)胞術(shù)檢測GFP表達(dá)，發(fā)現(xiàn)GFP陽性巨噬細(xì)胞在手術(shù)側(cè)腎臟明顯增加（16.47％±3.66%），血液中也有少量GFP陽性巨噬細(xì)胞（2.48%±2.54%）。注射細(xì)胞5天后病理檢測發(fā)現(xiàn)，小鼠管腔擴(kuò)大管壁變薄，腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤，腎小管上皮細(xì)胞的脫落壞死在注射過表達(dá)BVR巨噬細(xì)胞組最為明顯；組化結(jié)果顯示腎臟α-SMA、collagenIV和PDGFR-β表達(dá)在過表達(dá)BVR巨噬細(xì)胞注射組表達(dá)最多；Western blot結(jié)果顯示α-SMA

8、、PDGFR-β和Vimentin在過表達(dá)BVR巨噬細(xì)胞注射組表達(dá)升高。
　　結(jié)論：⑴注射GFP陽性巨噬細(xì)胞后細(xì)胞主要存在于缺血再灌注模型的手術(shù)側(cè)腎臟；⑵注射過表達(dá)BVR巨噬細(xì)胞腎臟纖維化和腎臟損傷與腺病毒陰性對照細(xì)胞注射相比有所加重。
　　第三部分、過表達(dá)膽綠素還原酶巨噬細(xì)胞對敲除巨噬細(xì)胞后急性腎損傷腎臟纖維化的影響
　　目的：通過脂質(zhì)體敲除巨噬細(xì)胞和重度腎臟缺血再灌注損傷建立巨噬細(xì)胞敲除急性腎損傷后腎臟纖維化，探討

9、過表達(dá)BVR巨噬細(xì)胞在巨噬細(xì)胞敲除后腎臟纖維化中的作用。
　　方法：將6周大小的C57BL/6雄性小鼠分為假手術(shù)組、敲除巨噬細(xì)胞手術(shù)組、注射過表達(dá)BVR細(xì)胞敲除巨噬細(xì)胞手術(shù)組和注射腺病毒陰性對照手術(shù)組。通過尾靜脈注射clodronate liposomes200μl兩天后，應(yīng)用FHC溫控系統(tǒng)建立重度腎臟缺血再灌注模型。在37℃條件下，假手術(shù)組開腹30分鐘；手術(shù)組夾閉左側(cè)腎臟30分鐘，右側(cè)腎臟不處理，術(shù)后一天通過尾靜脈注射過表達(dá)BV

10、R的巨噬細(xì)胞或?qū)φ障俨《揪奘杉?xì)胞（106/只），注射細(xì)胞5天后取標(biāo)本，用PAS染色觀察形態(tài)學(xué)變化，Masson和天狼星紅染色觀察纖維化情況，組化檢測α-SMA、collagenIV和PDGFR-β，Western blot檢測α-SMA、PDGFR-β和Vimentin，RT-PCR檢測COL1α1和Kim-1。
　　結(jié)果：注射細(xì)胞5天后病理檢測發(fā)現(xiàn)，小鼠管腔擴(kuò)大管壁變薄，腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤，腎小管上皮細(xì)胞的脫落壞死在注射過表達(dá)B

11、VR細(xì)胞敲除巨噬細(xì)胞手術(shù)組最為明顯；組化結(jié)果顯示腎臟α-SMA、collagenIV和PDGFR-β表達(dá)在過表達(dá)BVR細(xì)胞敲除巨噬細(xì)胞手術(shù)組表達(dá)最多；Western blot結(jié)果顯示α-SMA、PDGFR-β和Vimentin在過表達(dá)BVR細(xì)胞敲除巨噬細(xì)胞手術(shù)組表達(dá)升高。RT-PCR結(jié)果顯示COL1α1和Kim-1在過表達(dá)BVR細(xì)胞敲除巨噬細(xì)胞手術(shù)組表達(dá)升高。
　　結(jié)論：注射過表達(dá)BVR巨噬細(xì)胞腎臟纖維化和腎臟損傷與腺病毒陰性對照

12、細(xì)胞注射相比有所加重。
　　第四部分、過表達(dá)膽綠素還原酶巨噬細(xì)胞的功能
　　目的：探討過表達(dá)BVR小鼠巨噬細(xì)胞的功能。
　　方法：分離培養(yǎng)原代小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7，腺病毒包裝的BVR基因轉(zhuǎn)染骨髓來源的巨噬細(xì)胞，Western blot和RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率，然后用RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞INOS、ARG-1、TNF-α和IL-6的表達(dá)水平。分別給予GM-CSF100ng/ml和5

13、0ng/ml、M-CSF100ng/ml和50ng/ml刺激小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞24小時(shí)，RT-PCR檢測BVR表達(dá)，根據(jù)BVR表達(dá)情況確定GM-CSF和M-CSF刺激濃度。細(xì)胞轉(zhuǎn)染之后分別給予LPS1μg/ml、100ng/ml、GM-CSF100ng/ml和M-CSF100ng/ml刺激過表達(dá)BVR巨噬細(xì)胞24小時(shí)，用RT-PCR檢測細(xì)胞INOS、ARG-1、TNF-α和IL-6的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：在小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞

14、和小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7中均發(fā)現(xiàn)BVR過表達(dá)組巨噬細(xì)胞INOS、ARG-1、TNF-α和IL-6表達(dá)增加；同時(shí)經(jīng)過LPS1μg/ml和100ng/ml刺激24小時(shí)后，BVR過表達(dá)組巨噬細(xì)胞INOS、TNF-α和IL-6表達(dá)增加更加明顯，在LPS1μg/ml組更加明顯；經(jīng)GM-CSF100ng/ml、50ng/ml、M-CSF100ng/ml和50ng/ml分別刺激小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞24小時(shí)后，RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn) BVR在GM

15、-CSF100ng/ml組降低最明顯，而在M-CSF100ng/ml組升高最明顯，故選用100ng/ml濃度刺激過表達(dá)BVR巨噬細(xì)胞，GM-CSF刺激過表達(dá)BVR的巨噬細(xì)胞促進(jìn)INOS、TNF-α和IL-6表達(dá)增加，而M-CSF刺激BVR過表達(dá)巨噬細(xì)胞卻沒有這個(gè)作用。
　　結(jié)論：⑴過表達(dá)BVR巨噬細(xì)胞INOS、TNF-α和IL-6表達(dá)增加，LPS刺激過表達(dá)BVR的巨噬細(xì)胞促進(jìn)INOS、TNF-α和IL-6表達(dá)；⑵GM-CSF使過表