小鼠肝臟中CK19陽(yáng)性細(xì)胞分化特性的研究.pdf

1、目前，對(duì)于肝臟中具有干性的細(xì)胞（如肝前體細(xì)胞）已有不少的研究，但對(duì)于肝臟中真正的肝干細(xì)胞則缺乏認(rèn)識(shí)。一般認(rèn)為，這主要與有效研究體系的缺乏有關(guān)。在該研究領(lǐng)域中，不同實(shí)驗(yàn)室所報(bào)道的肝干性細(xì)胞的表型和分子特征存在著很大的差異，但他們所報(bào)道的這些干性細(xì)胞都有一個(gè)共同的特征，即都表達(dá)CK19?；谶@一現(xiàn)象，結(jié)合本人所在實(shí)驗(yàn)室前期關(guān)于肝前體細(xì)胞研究的發(fā)現(xiàn)，本人提出了“肝臟中的CK19+細(xì)胞譜系中可能包含有真正的肝干細(xì)胞(authentic live

2、r stem cell)”的科學(xué)假設(shè)。
　　本研究采用Cre/loxP體系對(duì)CK19+細(xì)胞譜系示蹤，并結(jié)合在肝細(xì)胞損傷和膽管損傷模型中對(duì)CK19+細(xì)胞分化特性的研究，對(duì)“肝臟中的CK19+細(xì)胞譜系中可能含有真正的肝干細(xì)胞”這一假設(shè)進(jìn)行了驗(yàn)證。在該研究中，首先將C57BL/6品系的CK19CreERT小鼠與Rsoa26-GFP小鼠進(jìn)行雜交，獲得了CK19CreERT/ Rosa26-GFP雙陽(yáng)性小鼠。在此基礎(chǔ)上，通過他莫昔芬(tam

3、oxifen，TM)的應(yīng)用，實(shí)現(xiàn)了肝臟中CK19+細(xì)胞的穩(wěn)定性遺傳標(biāo)記（即標(biāo)記上GFP），進(jìn)而，采用肝組織冰凍切片直接熒光顯微鏡觀察和免疫熒光分析，明確了這種標(biāo)記細(xì)胞在肝臟中的空間定位為門管區(qū)。隨后，利用這種CK19+細(xì)胞已被遺傳標(biāo)記的CK19CreERT/Rosa26-GFP小鼠制備了兩種肝臟損傷模型——DDC肝損傷模型和CCl4肝損傷模型，以用于被標(biāo)記的CK19+細(xì)胞是否具有肝向分化和膽向分化潛能的探討。在DDC損傷的小鼠模型中，可

4、以發(fā)生膽管損傷，并可出現(xiàn)損傷修復(fù)，表現(xiàn)為膽管反應(yīng)的發(fā)生。這種損傷模型，可用于研究被標(biāo)記的CK19+細(xì)胞是否具有分化為膽管上皮細(xì)胞的特性。在CCl4損傷的小鼠模型中，可以發(fā)生肝細(xì)胞的損傷，并可出現(xiàn)肝細(xì)胞的修復(fù)。這種損傷模型，可用于研究被標(biāo)記的CK19+細(xì)胞是否具有分化為成熟肝細(xì)胞的特性。本研究成功構(gòu)建了基于CK19CreERT/Rosa26-GFP小鼠的DDC肝損傷模型和CCl4肝損傷模型，并在此基礎(chǔ)上，分別對(duì)兩種肝損傷模型小鼠肝組織進(jìn)行

5、冰凍切片和免疫熒光檢測(cè)。在DDC損傷模型小鼠中發(fā)現(xiàn)，增生性小膽管中有GFP+細(xì)胞的出現(xiàn)，并通過免疫熒光檢測(cè)證實(shí)了這些GFP+細(xì)胞也表達(dá)CK19（膽管上皮細(xì)胞標(biāo)志物），說明存在于這些增殖性膽管中的CK19+細(xì)胞來源于譜系示蹤標(biāo)記的GFP+細(xì)胞，也提示了譜系示蹤標(biāo)記的GFP+細(xì)胞譜系中有具有膽向分化潛能的細(xì)胞類型的存在;在CCl4損傷模型小鼠中發(fā)現(xiàn)，肝小葉中有GFP+細(xì)胞的出現(xiàn)，并通過免疫熒光檢測(cè)證實(shí)了這些GFP+細(xì)胞也表達(dá)ALB（成熟肝細(xì)