CK19啟動子調(diào)控的雙報告載體的構(gòu)建及其在肝干-祖細(xì)胞分化研究中的應(yīng)用.pdf

1、終末期肝病是威脅我國人民生命健康的一大類疾病，目前臨床上治療它的最有效的辦法是原位肝移植(orthotopic liver transplantation，OLT)，但因其供體極度短缺極大地限制了這一治療手段的廣泛開展。對于這一問題，肝臟組織工程構(gòu)建無異于是一個好的解決辦法。眾所周知，肝臟中的實質(zhì)細(xì)胞除了占絕對主體的肝細(xì)胞外，還存在著膽管上皮細(xì)胞(biliary epithelial cells，BECs)，雖然BECs僅占肝臟細(xì)胞總數(shù)

2、的3％～5％，但其有著重要的功能，比如：分泌膽汁、調(diào)節(jié)膽汁的組成、控制膽汁流量和運輸膽汁。BECs的這些功能可以很好地維持肝臟功能的完整性。因此，在肝臟的組織工程學(xué)研究中，要想得到結(jié)構(gòu)功能兼?zhèn)涞母螁卧Y(jié)構(gòu)，同肝細(xì)胞一樣，BECs也是必不可少的。然而，目前肝臟組織工程的研究方向主要集中在向肝細(xì)胞的誘導(dǎo)分化上，對于BECs的研究甚少。具有高度自我更新和發(fā)育全能性的胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ES cells)在適宜

3、的環(huán)境中可以向各種組織細(xì)胞分化，有望為肝臟的組織工程提供理想種子細(xì)胞。本研究主要分為兩大部分，在第一部分中，我們首先建立了CK19啟動子調(diào)控的雙報告載體，經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染肝干/祖細(xì)胞(hepatic progenitor cells，HPCs)系，建立了穩(wěn)定表達的細(xì)胞系，之后利用體外共培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)HPCs分化為BECs，驗證了報告載體的功能；在第二部分中，我們在體外培養(yǎng)了小鼠ES細(xì)胞，并且建立了穩(wěn)定表達報告載體的小鼠ES細(xì)胞系。這一研究不

4、僅提供了純化目的細(xì)胞的手段，同時也為以細(xì)胞治療和基因治療為基礎(chǔ)的肝臟再生醫(yī)學(xué)的基礎(chǔ)研究提供了一些方法。
　　 本研究主要包括以下兩部分內(nèi)容。
　　 一、CK19啟動子調(diào)控的雙報告載體的構(gòu)建
　　 近年來，遺傳修飾技術(shù)的逐步成熟為細(xì)胞分化研究提供了便利的工具。遺傳修飾技術(shù)可以方便地“跟蹤”目標(biāo)細(xì)胞分化的情況，從而能夠使原本不易察覺的分化過程變得易于研究。在本研究中我們首先構(gòu)建了由BECs較為特異的標(biāo)志CK19啟動子

5、調(diào)控的雙報告載體pCK19-Rluc-mRFP，然后通過遺傳修飾技術(shù)建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達載體pCK19-Rluc-mRFP的HPCs。接下來，我們利用EPM-PT67細(xì)胞與HPCs穩(wěn)定株共培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)后者分化為BECs，之后通過細(xì)胞形態(tài)的變化、RT-PCR和Western-blot等結(jié)果說明HPCs被誘導(dǎo)到了BECs，同時海腎熒光素酶和紅色熒光蛋白的表達情況說明我們構(gòu)建的報告載體pCK19-Rluc-mRFP在細(xì)胞分化過程中能夠發(fā)揮指示

6、和報告作用。
　　 (一)在肝臟中CK19是BECs的特異性基因
　　 肝系細(xì)胞在發(fā)育分化過程中缺乏一致的特異性標(biāo)志物，只有一些高度表達的標(biāo)志物，這些標(biāo)志為我們識別成功誘導(dǎo)分化的細(xì)胞奠定了一定的基礎(chǔ)，其中特異性標(biāo)記的篩選在分化細(xì)胞的鑒定中具有更重要的意義。
　　 細(xì)胞角蛋白(cytokeratins，CKs)是一種分化特異的蛋白質(zhì)，屬于中間纖維家族，與細(xì)胞分化和細(xì)胞骨架的組織有關(guān)。CKs廣泛存在于上皮類細(xì)胞中，是

7、其重要的標(biāo)志。CKs在很多組織(如：肝臟、胰腺、膀胱等)的上皮細(xì)胞中都有表達，其中CK19呈高表達狀態(tài)，但是在肝臟中CK19是BECs的特異性標(biāo)志基因[1，2]。Michael Lie-A-Ling等為了更早期更準(zhǔn)確地診斷膽管癌，在BECs的多種標(biāo)志物中篩選出了CK19，并構(gòu)建了由人CK19啟動子啟動螢火蟲熒光素酶的質(zhì)粒pShuttle-CK19-Luc，然后將其轉(zhuǎn)入人膽管癌細(xì)胞中以測定其表達效率，在候選的啟動子中CK19啟動子比其它更

8、高效地表達。這樣通過測定各種標(biāo)志物的表達效率，Michael Lie-A-Ling等認(rèn)為CK19是BECs的較為特異性基因[3]。
　　 (二)表達載體pCK19-Rluc-mRFP的構(gòu)建
　　 CK19在BECs中高表達，是識別BECs的一個較為特異的細(xì)胞標(biāo)志。在本實驗中，我們首先從HepG2細(xì)胞的全基因組、pcDNA3.1-hrl-mrfp-ttk載體[4]和pcDNA3.1質(zhì)粒中用高保真DNA聚合酶分別擴增出CK1

9、9核心啟動子、Rluc-mRFP序列和poly A序列三個目的片段，然后通過相應(yīng)地酶切位點將三個目的片段插入慢病毒干涉載體pSicoR-GFP，這樣就構(gòu)建成了一個由CK19啟動子調(diào)控Rluc-mRFP的表達載體pCK19-Rluc-mRFP。四酶切鑒定顯示出載體中含有744bp、1650bp和225bp大小的三個插入片段，測序鑒定也證明了載體中插入片段的正確性。另外，該載體中還含有一段可以編碼綠色熒光蛋白(green fluoresce

10、nt protein，GFP)的基因，可將此作為獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pCK19-Rluc-mRFP表達載體的細(xì)胞株的標(biāo)記。
　　 (三)通過共培養(yǎng)誘導(dǎo)WB細(xì)胞分化為BECs對表達載體進行功能驗證
　　 WB-F344(簡稱WB)細(xì)胞是從正常成年雄性Fisher大鼠肝臟中分離出的一類HPCs[5.6]，非致癌性，在表型上具有HPCs的特征[7，8]。我們引入WB細(xì)胞是因為它在體內(nèi)可以分化為肝細(xì)胞[9]和BECs[10]，在體外也是

11、研究向肝細(xì)胞[11]和BECs[12]分化的一個良好的HPCs模型，故可以作為驗證構(gòu)建的表達載體功能方面的模型細(xì)胞。我們通過慢病毒感染將表達載體pCK19-Rluc-mRFP整合入WB細(xì)胞的基因組中，得到了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pCK19-Rluc-mRFP基因片段的WB細(xì)胞株。接下來，我們利用EPM-PT67細(xì)胞(系我實驗室利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將EPM質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進PT67細(xì)胞中并通過極限稀釋法篩選出穩(wěn)定表達EPM的PT67細(xì)胞)與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染表達載體pCK1

12、9-Rluc-mRFP的WB細(xì)胞共培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)后者分化為BECs(此誘導(dǎo)BECs分化的方法系由我實驗室姚海雷博士和賈雅麗博士共同創(chuàng)建)。我們發(fā)現(xiàn)不僅WB細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了變化排列為二維環(huán)狀結(jié)構(gòu)，而且RT-PCR和Western-blot的結(jié)果也證明共培養(yǎng)方法使WB細(xì)胞分化為了BECs。從與對照組比較的結(jié)果可知觀測到的紅色熒光和海腎熒光確實是由其上游的CK19啟動子啟動后表達的，而且經(jīng)定量檢測發(fā)現(xiàn)實驗組比對照組的海腎熒光素酶的表達量增加了1

13、3.6倍。綜合這些實驗結(jié)果我們可以知道構(gòu)建的表達載體pCK19-Rluc-mRFP不僅在結(jié)構(gòu)上完全正確而且能夠方便地反映出HPCs向上皮樣細(xì)胞分化的情況。同時，這一載體的構(gòu)建也為HPCs和ES細(xì)胞向BECs分化機制的研究提供了便捷的工具。
　　 二、穩(wěn)定表達pCK19-Rluc-mRFP載體的小鼠ES細(xì)胞系的建立
　　 ES細(xì)胞是胚胎細(xì)胞或原始生殖細(xì)胞經(jīng)體外分化抑制培養(yǎng)而篩選出的細(xì)胞，它具有發(fā)育上的全能性。它在發(fā)育階段上

14、類似于早期胚胎的內(nèi)細(xì)胞團細(xì)胞，具有與早期胚胎相似的分化潛能，此外它還兼有胚胎細(xì)胞和體細(xì)胞的相似的特征，既可進行體外培養(yǎng)、擴增，又可分化為三個胚層的各種組織[13-19]。ES細(xì)胞被廣泛應(yīng)用于組織工程、動物克隆、哺乳動物基因的表達與調(diào)控研究以及發(fā)育生物學(xué)研究等領(lǐng)域，并有望為心肌壞死、帕金森疾病、糖尿病、肝功能衰竭、Duchenne's肌營養(yǎng)不良等疾病提供根治的手段[20-22]。1981年Evans建立了第一個小鼠ES細(xì)胞系[23]，此后

15、以此細(xì)胞系為模型已經(jīng)成功地誘導(dǎo)出三個胚層的20多種細(xì)胞類型。為維持小鼠ES細(xì)胞的干性，我們將其培養(yǎng)在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mouse embryonicfibroblast，MEF)上，建立了標(biāo)準(zhǔn)的小鼠ES細(xì)胞體外培養(yǎng)體系。
　　 在前面的研究中，我們從結(jié)構(gòu)和功能上同時證明了所構(gòu)建的表達載體pCK19-Rluc-mRFP的正確性和實效性。接下來，我們通過慢病毒感染將表達載體pCK19-Rluc-mRFP轉(zhuǎn)入小鼠ES細(xì)胞，然后通過流

16、式細(xì)胞術(shù)分選出表達GFP的小鼠ES細(xì)胞。經(jīng)過體外多次傳代培養(yǎng)，小鼠ES細(xì)胞穩(wěn)定表達GFP，并且還能在體外分化為擬胚體(embryoid body，EB)。證明我們得到了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pCK19-Rluc-mRFP基因片段的小鼠ES細(xì)胞，這一結(jié)果的應(yīng)用可能為日后純化ES細(xì)胞和ES細(xì)胞來源的上皮類細(xì)胞提供新的方法。
　　 綜上所述，我們通過構(gòu)建CK19啟動子調(diào)控的RFP報告系統(tǒng)可以實時地研究HPCs在不同誘導(dǎo)條件下的分化去向，同時通過CK