CK19啟動子調控的雙報告載體的構建及其在肝干-祖細胞分化研究中的應用.pdf

1、終末期肝病是威脅我國人民生命健康的一大類疾病，目前臨床上治療它的最有效的辦法是原位肝移植(orthotopic liver transplantation，OLT)，但因其供體極度短缺極大地限制了這一治療手段的廣泛開展。對于這一問題，肝臟組織工程構建無異于是一個好的解決辦法。眾所周知，肝臟中的實質細胞除了占絕對主體的肝細胞外，還存在著膽管上皮細胞(biliary epithelial cells，BECs)，雖然BECs僅占肝臟細胞總數

2、的3％～5％，但其有著重要的功能，比如：分泌膽汁、調節(jié)膽汁的組成、控制膽汁流量和運輸膽汁。BECs的這些功能可以很好地維持肝臟功能的完整性。因此，在肝臟的組織工程學研究中，要想得到結構功能兼?zhèn)涞母螁卧Y構，同肝細胞一樣，BECs也是必不可少的。然而，目前肝臟組織工程的研究方向主要集中在向肝細胞的誘導分化上，對于BECs的研究甚少。具有高度自我更新和發(fā)育全能性的胚胎干細胞(embryonic stem cells，ES cells)在適宜

3、的環(huán)境中可以向各種組織細胞分化，有望為肝臟的組織工程提供理想種子細胞。本研究主要分為兩大部分，在第一部分中，我們首先建立了CK19啟動子調控的雙報告載體，經慢病毒轉染肝干/祖細胞(hepatic progenitor cells，HPCs)系，建立了穩(wěn)定表達的細胞系，之后利用體外共培養(yǎng)的方法誘導HPCs分化為BECs，驗證了報告載體的功能；在第二部分中，我們在體外培養(yǎng)了小鼠ES細胞，并且建立了穩(wěn)定表達報告載體的小鼠ES細胞系。這一研究不

4、僅提供了純化目的細胞的手段，同時也為以細胞治療和基因治療為基礎的肝臟再生醫(yī)學的基礎研究提供了一些方法。
　　 本研究主要包括以下兩部分內容。
　　 一、CK19啟動子調控的雙報告載體的構建
　　 近年來，遺傳修飾技術的逐步成熟為細胞分化研究提供了便利的工具。遺傳修飾技術可以方便地“跟蹤”目標細胞分化的情況，從而能夠使原本不易察覺的分化過程變得易于研究。在本研究中我們首先構建了由BECs較為特異的標志CK19啟動子

5、調控的雙報告載體pCK19-Rluc-mRFP，然后通過遺傳修飾技術建立了穩(wěn)定轉染表達載體pCK19-Rluc-mRFP的HPCs。接下來，我們利用EPM-PT67細胞與HPCs穩(wěn)定株共培養(yǎng)的方法誘導后者分化為BECs，之后通過細胞形態(tài)的變化、RT-PCR和Western-blot等結果說明HPCs被誘導到了BECs，同時海腎熒光素酶和紅色熒光蛋白的表達情況說明我們構建的報告載體pCK19-Rluc-mRFP在細胞分化過程中能夠發(fā)揮指示

6、和報告作用。
　　 (一)在肝臟中CK19是BECs的特異性基因
　　 肝系細胞在發(fā)育分化過程中缺乏一致的特異性標志物，只有一些高度表達的標志物，這些標志為我們識別成功誘導分化的細胞奠定了一定的基礎，其中特異性標記的篩選在分化細胞的鑒定中具有更重要的意義。
　　 細胞角蛋白(cytokeratins，CKs)是一種分化特異的蛋白質，屬于中間纖維家族，與細胞分化和細胞骨架的組織有關。CKs廣泛存在于上皮類細胞中，是

7、其重要的標志。CKs在很多組織(如：肝臟、胰腺、膀胱等)的上皮細胞中都有表達，其中CK19呈高表達狀態(tài)，但是在肝臟中CK19是BECs的特異性標志基因[1，2]。Michael Lie-A-Ling等為了更早期更準確地診斷膽管癌，在BECs的多種標志物中篩選出了CK19，并構建了由人CK19啟動子啟動螢火蟲熒光素酶的質粒pShuttle-CK19-Luc，然后將其轉入人膽管癌細胞中以測定其表達效率，在候選的啟動子中CK19啟動子比其它更

8、高效地表達。這樣通過測定各種標志物的表達效率，Michael Lie-A-Ling等認為CK19是BECs的較為特異性基因[3]。
　　 (二)表達載體pCK19-Rluc-mRFP的構建
　　 CK19在BECs中高表達，是識別BECs的一個較為特異的細胞標志。在本實驗中，我們首先從HepG2細胞的全基因組、pcDNA3.1-hrl-mrfp-ttk載體[4]和pcDNA3.1質粒中用高保真DNA聚合酶分別擴增出CK1

9、9核心啟動子、Rluc-mRFP序列和poly A序列三個目的片段，然后通過相應地酶切位點將三個目的片段插入慢病毒干涉載體pSicoR-GFP，這樣就構建成了一個由CK19啟動子調控Rluc-mRFP的表達載體pCK19-Rluc-mRFP。四酶切鑒定顯示出載體中含有744bp、1650bp和225bp大小的三個插入片段，測序鑒定也證明了載體中插入片段的正確性。另外，該載體中還含有一段可以編碼綠色熒光蛋白(green fluoresce

10、nt protein，GFP)的基因，可將此作為獲得穩(wěn)定轉染pCK19-Rluc-mRFP表達載體的細胞株的標記。
　　 (三)通過共培養(yǎng)誘導WB細胞分化為BECs對表達載體進行功能驗證
　　 WB-F344(簡稱WB)細胞是從正常成年雄性Fisher大鼠肝臟中分離出的一類HPCs[5.6]，非致癌性，在表型上具有HPCs的特征[7，8]。我們引入WB細胞是因為它在體內可以分化為肝細胞[9]和BECs[10]，在體外也是

11、研究向肝細胞[11]和BECs[12]分化的一個良好的HPCs模型，故可以作為驗證構建的表達載體功能方面的模型細胞。我們通過慢病毒感染將表達載體pCK19-Rluc-mRFP整合入WB細胞的基因組中，得到了穩(wěn)定轉染pCK19-Rluc-mRFP基因片段的WB細胞株。接下來，我們利用EPM-PT67細胞(系我實驗室利用脂質體轉染法將EPM質粒轉染進PT67細胞中并通過極限稀釋法篩選出穩(wěn)定表達EPM的PT67細胞)與穩(wěn)定轉染表達載體pCK1

12、9-Rluc-mRFP的WB細胞共培養(yǎng)的方法誘導后者分化為BECs(此誘導BECs分化的方法系由我實驗室姚海雷博士和賈雅麗博士共同創(chuàng)建)。我們發(fā)現(xiàn)不僅WB細胞形態(tài)發(fā)生了變化排列為二維環(huán)狀結構，而且RT-PCR和Western-blot的結果也證明共培養(yǎng)方法使WB細胞分化為了BECs。從與對照組比較的結果可知觀測到的紅色熒光和海腎熒光確實是由其上游的CK19啟動子啟動后表達的，而且經定量檢測發(fā)現(xiàn)實驗組比對照組的海腎熒光素酶的表達量增加了1

13、3.6倍。綜合這些實驗結果我們可以知道構建的表達載體pCK19-Rluc-mRFP不僅在結構上完全正確而且能夠方便地反映出HPCs向上皮樣細胞分化的情況。同時，這一載體的構建也為HPCs和ES細胞向BECs分化機制的研究提供了便捷的工具。
　　 二、穩(wěn)定表達pCK19-Rluc-mRFP載體的小鼠ES細胞系的建立
　　 ES細胞是胚胎細胞或原始生殖細胞經體外分化抑制培養(yǎng)而篩選出的細胞，它具有發(fā)育上的全能性。它在發(fā)育階段上

14、類似于早期胚胎的內細胞團細胞，具有與早期胚胎相似的分化潛能，此外它還兼有胚胎細胞和體細胞的相似的特征，既可進行體外培養(yǎng)、擴增，又可分化為三個胚層的各種組織[13-19]。ES細胞被廣泛應用于組織工程、動物克隆、哺乳動物基因的表達與調控研究以及發(fā)育生物學研究等領域，并有望為心肌壞死、帕金森疾病、糖尿病、肝功能衰竭、Duchenne's肌營養(yǎng)不良等疾病提供根治的手段[20-22]。1981年Evans建立了第一個小鼠ES細胞系[23]，此后

15、以此細胞系為模型已經成功地誘導出三個胚層的20多種細胞類型。為維持小鼠ES細胞的干性，我們將其培養(yǎng)在小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonicfibroblast，MEF)上，建立了標準的小鼠ES細胞體外培養(yǎng)體系。
　　 在前面的研究中，我們從結構和功能上同時證明了所構建的表達載體pCK19-Rluc-mRFP的正確性和實效性。接下來，我們通過慢病毒感染將表達載體pCK19-Rluc-mRFP轉入小鼠ES細胞，然后通過流

16、式細胞術分選出表達GFP的小鼠ES細胞。經過體外多次傳代培養(yǎng)，小鼠ES細胞穩(wěn)定表達GFP，并且還能在體外分化為擬胚體(embryoid body，EB)。證明我們得到了穩(wěn)定轉染pCK19-Rluc-mRFP基因片段的小鼠ES細胞，這一結果的應用可能為日后純化ES細胞和ES細胞來源的上皮類細胞提供新的方法。
　　 綜上所述，我們通過構建CK19啟動子調控的RFP報告系統(tǒng)可以實時地研究HPCs在不同誘導條件下的分化去向，同時通過CK