構(gòu)建實(shí)時(shí)監(jiān)測小鼠、大鼠、人干細(xì)胞肝向分化狀態(tài)的白蛋白啟動子報(bào)告系統(tǒng)及其應(yīng)用.pdf

1、目的:構(gòu)建攜帶小鼠、大鼠、人白蛋白啟動子通用序列的腺病毒載體，研究其在三個(gè)種屬的肝臟來源細(xì)胞、非肝臟來源細(xì)胞及干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的肝細(xì)胞樣細(xì)胞中對白蛋白的檢測，為干細(xì)胞肝向分化狀態(tài)的實(shí)時(shí)監(jiān)測提供新的方法。
　　方法:(1).實(shí)驗(yàn)細(xì)胞:人肝癌細(xì)胞HepG2、小鼠肝癌細(xì)胞Hepa1-6培養(yǎng)基選用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基。采用原位兩步膠原酶灌流法進(jìn)行大鼠原代肝細(xì)胞的分離及純化，獲得的原代肝細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行膠原-Matrigel

2、三明治夾心培養(yǎng)。SD大鼠MSC生長培養(yǎng)基培養(yǎng)第6-8代大鼠BM-MSCs。取第4-6代小鼠BM-MSCs，采用C57BL/6小鼠MSC生長培養(yǎng)基。所有細(xì)胞培養(yǎng)條件均為37℃，5％ CO2，飽和濕度。在對數(shù)生長期時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代，24小時(shí)后，細(xì)胞密度為50-70％轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒或病毒。(2).構(gòu)建重組質(zhì)粒pDRIVE-SV40-Albp-LacZ及質(zhì)粒轉(zhuǎn)染:根據(jù)①啟動子數(shù)據(jù)庫預(yù)測白蛋白啟動子長1000bp，位于-700/+299;②表達(dá)載體容

3、量;③轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，從Gene Bank BLAST中獲得三段人白蛋白啟動子片段，然后將這三段啟動子片段送至漢恒生物分別制得轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pDRIVE-SV40-Albp-LacZ的三種GT100 E.coli，擴(kuò)增E.coli，提取質(zhì)粒，分光光度計(jì)測量質(zhì)粒DNA的濃度。三種重組質(zhì)粒脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染Hepa1-6，顯微鏡觀察加入X-gal后各組細(xì)胞藍(lán)色沉淀的生成。利用Image-pro Plus6.0軟件，人工計(jì)算藍(lán)染細(xì)胞比率。(3).構(gòu)

4、建SV40-Albp-ZsGreen腺病毒載體并感染肝臟及非肝臟來源細(xì)胞:從上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hepa1-6試驗(yàn)中，獲得-173/+36(210bp，F(xiàn)ragment3)為白蛋白啟動子轉(zhuǎn)錄活性最高的片段。依據(jù)質(zhì)粒pDRIVE-SV40-Albp-LacZ轉(zhuǎn)染Hepa1-6實(shí)驗(yàn)結(jié)果，SV40增強(qiáng)子與白蛋白啟動子的連接可有效調(diào)控LacZ基因的表達(dá)，所以在構(gòu)建腺病毒載體時(shí)我們也采用SV40增強(qiáng)子與白蛋白啟動子連接，以保證白蛋白啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。

5、SV40增強(qiáng)子與白蛋白啟動子連接片段(SV40-Albp)序列由漢恒生物提供，從Gene Bank中獲得ZsGreen序列。按照引物設(shè)計(jì)的原則設(shè)計(jì)SV40-Albp及報(bào)告基因ZsGreen引物，人工合成SV40-Albp片段及ZsGreen。亞克隆至切除啟動子的表達(dá)載體pHBAd-U6-CMV的XbaⅠ/MluⅠ酶切位點(diǎn)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coli DH5α，篩選含有目的基因的表達(dá)質(zhì)粒pHBAd-SV40-Albp-ZsGreen陽

6、性克隆，經(jīng)酶切、測序鑒定正確后，和骨架質(zhì)粒pHBAd-BHG脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞系HEK293細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝、擴(kuò)增、并檢測病毒滴度。SV40-Albp-ZsGreen腺病毒載體感染肝臟及非肝臟來源細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡觀察ZsGreen基因的表達(dá)，并以CMV-GFP腺病毒載體作為陽性對照。同時(shí)進(jìn)行細(xì)胞爬片，免疫熒光染色檢測各細(xì)胞ALB表達(dá)。(4).SV40-Albp-ZsGreen腺病毒載體感染肝向分化的小鼠BM-MSCs:采用兩步法

7、誘導(dǎo)方案（第一步:20 ng/ml HGF+10 ng/mlbFGF+0.61g/ml NAM培養(yǎng)7天，第二步:20ng/ml OSM+1umol/LDXM+50mg/ml ITS14天）誘導(dǎo)小鼠BM-MSCs向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化。21天后，SV40-Albp-ZsGreen腺病毒載體感染肝向分化的細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡觀察ZsGreen基因的表達(dá)，并以CMV-GFP腺病毒載體作為陽性對照。同時(shí)，肝向分化的細(xì)胞爬片，免疫熒光染色檢測ALB表

8、達(dá)。
　　結(jié)果:(1).重組質(zhì)粒pDRIVE-SV40-Albp-LacZ的構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄活性最高的ALB啟動子片段篩選:從Gene Bank BLAST中獲得三段人白蛋白啟動子片段-247/+36(284bp,Fragment1),-173/-23(151bp,Fragment2)和-173/+36(210bp,Fragment3)，并成功構(gòu)建三種重組質(zhì)粒pDRIVE-SV40-Albp-LacZ，轉(zhuǎn)染Hepa1-6，細(xì)胞中均有藍(lán)色

9、沉淀生成。Fragment3所在質(zhì)粒組細(xì)胞藍(lán)染比率最高。選取Fragment3用于下一步實(shí)驗(yàn)。(2).SV40-Albp-ZsGreen腺病毒載體的構(gòu)建及對各組細(xì)胞ALB的檢測:經(jīng)酶切及測序明確攜帶SV40-Albp和ZsGreen基因的SV40-Albp-ZsGreen腺病毒載體構(gòu)建成功，TCID50測定病毒的感染滴度2×1010PFU/mL，感染肝臟來源細(xì)胞，顯微鏡下均可見不同程度的綠色熒光，非肝臟來源細(xì)胞無綠色熒光表達(dá)。陽性對照組

10、中，均出現(xiàn)高亮度的綠色熒光。免疫熒光染色顯示，ALB表達(dá)與ZsGreen綠色熒光蛋白表達(dá)趨勢一致。(3).SV40-Albp-ZsGreen腺病毒載體對小鼠BM-MSCs肝向分化細(xì)胞ALB的檢測:成功培養(yǎng)出小鼠BM-MSCs，接種第4-6代后。21天誘導(dǎo)后， SV40-Albp-ZsGreen腺病毒載體感染的肝細(xì)胞樣細(xì)胞于倒置熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光蛋白的表達(dá)，陽性對照組中，可觀察到高亮度的綠色熒光。免疫熒光染色檢測的ALB表達(dá)與Z