人類心肌α-actin啟動子真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在ES細(xì)胞中的初步應(yīng)用.pdf

1、心肌壞死導(dǎo)致心肌細(xì)胞死亡,進(jìn)一步導(dǎo)致心衰、心肌重構(gòu)等.由于成年化的心肌細(xì)胞不能分裂,尋找可替代死亡心肌細(xì)胞的移植物來治療心肌壞死是近年來研究的熱點.胚胎干細(xì)胞具有多分化潛能,適宜條件下可分化為多種細(xì)胞,從而構(gòu)成機(jī)體的不同器官與組織.利用ES細(xì)胞的分化潛能和定向分化的可調(diào)性,將胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞,可以作為心肌細(xì)胞移植治療的細(xì)胞來源.但是,對這種來源的心肌細(xì)胞要求很高純度,因為全能干細(xì)胞移植到個體可能會導(dǎo)致畸胎瘤.研究表明,通過基

2、因操作可以從分化的ES細(xì)胞中純化獲得所需的心肌細(xì)胞.α-actin是心臟發(fā)生的最早標(biāo)志,在ES細(xì)胞分化為自發(fā)收縮的心肌細(xì)胞之前特異性表達(dá),指導(dǎo)其組織特異性表達(dá)的是α-actin基因啟動子.對這一啟動子的研究,不僅可間接研究心肌發(fā)育過程,更重要的是可以用來做調(diào)控序列純化ES細(xì)胞源心肌細(xì)胞作移植治療.該實驗的目的旨在構(gòu)建出含人類心肌α-actin啟動子的真核表達(dá)載體,用來轉(zhuǎn)染小鼠ES細(xì)胞,純化和進(jìn)一步研究ES細(xì)胞源心肌細(xì)胞.我們用PCR法直

3、接從全基因組中擴(kuò)增人類心肌α-actin基因的啟動子片段,連接到pMD-18T載體上,酶切鑒定并測序.進(jìn)而將這一調(diào)控區(qū)與去掉巨細(xì)胞病毒啟動子的真核表達(dá)載體pEGFP-N1(4.1kb)進(jìn)行重組,獲得了真核表達(dá)載體,命名為α-actin-pEGFP-N1.將α-actin-pEGFP-N1純化后,通過脂質(zhì)體包裹轉(zhuǎn)染小鼠ES細(xì)胞,進(jìn)行免疫組化染色.該研究分為兩部分:1、根據(jù)已發(fā)表的人類心肌α-actin啟動子基因的序列設(shè)計1對含有特異性酶切

4、位點的引物,并利用PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增.序列分析表明,擴(kuò)增片段雖然與Genbank里登陸的序列同源性僅為72%,但包含有完整的啟動子元件和轉(zhuǎn)錄專一調(diào)節(jié)因子相應(yīng)的識別序列,尤其是(AP1、SP1、TATA盒、CAAT盒、轉(zhuǎn)錄起始點等).2、嘗試用pEGFP-N1作為框架結(jié)構(gòu),獲得了含人類心肌α-actin啟動子的真核表達(dá)載體α-actin-pEGFP-N1;用純化的EGFP質(zhì)粒,在不同的條件下轉(zhuǎn)染小鼠ES細(xì)胞,摸索與優(yōu)化實驗條件.結(jié)果表明: