針對性殺傷K19陽性細胞在腫瘤基因治療中的價值初探.pdf

1、研究目的：構建角蛋白19（K19）啟動子驅動表達的單純皰疹病毒I型胸苷激酶基因（HSV-TK）載體系統(tǒng)，探討其在腫瘤的基因治療中的意義。
　　 材料與方法：
　　 pK15-Tk來自賓夕凡尼亞大學醫(yī)學院George Cotsarelis教授的饋贈。PAM212是一種惡性轉化的小鼠角質形成細胞系，由美國國立衛(wèi)生研究院Stuart Yuspa教授饋贈，第二軍醫(yī)大學李晉處獲得。
　　 基因組DNA抽提試劑盒及Pfu T

2、aq酶購自申能博彩，PrimeSTAR'HS DNA多聚酶購自大連寶生物。PCR產物膠回收試劑盒購自E.Z.N.A公司。DMEM培養(yǎng)基（Hyclone），胎牛血清（美國GIBCO公司），轉染試劑Lipofectamine 2000和Opti-MEM均購自美國Invitrogen公司。
　　 1.K19啟動子的擴增和載體的構建
　　 用基因組DNA抽提試劑盒從出生4天內Balb/c小鼠的皮膚組織中抽提基因組DNA，處死新生

3、鼠后，將其在70%酒精中飄洗兩遍，在無菌環(huán)境下剝除部分皮膚，接下來的具體方法參照說明書。
　　 PCR方法從Balb/c小鼠的基因組DNA中擴增出K19啟動子區(qū)域。PCR中使用了兩套引物來擴增兩種不同大小的K19啟動子片段。擴增完整序列(－2.1Kb)的引物是CGGCTCGAGAAGTTCCTTTCTAAGACCCA (K19F1)和AGGACTAGTGGAAAAAGGGACGCAGGTCT (K19R)；擴增部分序列（－0.5

4、Kb）的引物是AGGCTCGAGTTATCACAAGGAGGGAGGGA (K19F1)和AGGACTAGTGGAAAAAGGGACGCAGGTCT (K19R)。分別在兩對引物5’端引入Xho 1和 Spe I的酶切位點。使用Pfu Taq酶從0.2ug基因組中擴增K19(－0.5Kb)反應條件：初始變性在95℃ 4分鐘后，30個循環(huán)分別為95℃變性、退火57℃、延伸72℃均為60秒，最后延伸為72℃8分鐘。用PrimeSTAR'HS

5、 DNA多聚酶從0.5ug基因組DNA中擴增K19(－2.1Kb)反應條件：初始變性在95℃ 4分鐘后，30個循環(huán)分別為98℃變性、退火54℃、延伸72℃分別為10S、15S和兩分鐘，最后延伸為72℃10分鐘。所得PCR產物經瓊脂糖電泳分離，用膠回收試劑盒純化，Xho 1和 Spe I限制內切酶酶切5小時后再次瓊脂糖電泳分離、膠回收試劑盒純化。所得DNA片段與pK15-tk酶切后的片段用連接試劑盒16℃連接1小時，GaCl2法轉化DH5

6、a感受態(tài)細胞。構建質粒經酶切、瓊脂糖電泳鑒定后將符合的克隆送測序。
　　 2.細胞培養(yǎng)和瞬時轉染
　　 Pam212細胞系和人肺癌細胞系A549以及人宮頸癌細胞系Siha和Hela在DMEM培養(yǎng)基（添加10％胎牛血清）中培養(yǎng)。每三到四天換液，接近融合時消化成單細胞懸液接種在6孔板中。細胞轉染依照說明書進行，簡言之，細胞接種在6孔板后，一般經過夜培養(yǎng)后達到90%融合且生長在對數(shù)期，脂質體和質粒DNA以6μl：4μg的比例分

7、別在250ul Opti-MEM中稀釋，將二者混勻后加入培養(yǎng)液中。在培養(yǎng)箱中經過48小時的培養(yǎng)后，換液并加入GCV（濃度為100 μM）。
　　 3.MTT細胞活力測定
　　 首先，0.2μg質粒DNA和0.5μl的脂質體分別在25μl的Opti-MEM中稀釋，混勻后的復合物加入96孔板中，20分鐘后100ul的單細胞懸液被直接接種到孔板中，在培養(yǎng)箱中經過48小時的培養(yǎng)后，GCV依照不同濃度加入培養(yǎng)液中（0，2μM，10

8、μM，100 μM）。72小時過后，MTT法測定細胞活力。
　　 4.流式細胞學檢測
　　 轉染后的細胞在含有100μMGCV的培養(yǎng)液中孵育72小時后，棄去培養(yǎng)液，用PBS洗一遍，消化成單細胞懸液，1500RPM離心5分鐘，再次用PBS洗，在預冷的70%乙醇中放置過夜，離心去除乙醇，用含PI(propidium iodide)的DNA染色劑避光染色半小時后，流式細胞儀檢測。
　　 結果：
　　 1.GCV

9、誘導轉染后的PAM212、A549細胞死亡呈劑量依賴性
　　 MTT結果表明，轉染細胞以PAM212為例，加入GCV72小時后，用不加GCV組結果調零后，2μM濃度組有19.4%的細胞死亡，10mM和100mM分別為44.4%和 58.7%。A549的結果與之較為相似，但是出乎我們意料的是，兩種人宮頸癌細胞系Hela、Siha在轉染后并沒表現(xiàn)出對GCV的敏感性，細胞活力各組之間沒有明顯的差別。
　　 2.細胞周期分析