標記MMPs陽性細胞的光學成像新方法在腫瘤細胞侵襲和轉(zhuǎn)移活性評價中的應用.pdf

1、對正常組織的侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的兩大特征。腫瘤細胞對周圍組織的侵襲程度和是否容易發(fā)生轉(zhuǎn)移是腫瘤惡性程度的重要標志。并且是腫瘤導致病人死亡的主要原因?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是降解細胞外基質(zhì)中各種蛋白質(zhì)成分以及破壞組織重塑的特異性內(nèi)肽酶類，能夠破壞組織學屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關鍵性作用?；|(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）和膜型基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MT1-MMP）作為基質(zhì)金屬蛋白酶中最重要的兩種酶和腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和血管形成緊密相關。在各種

2、腫瘤中，MMP2常以無活性的酶原形式（proMMP）過表達，經(jīng)過MT1-MMP的蛋白裂解作用，proMMP活化成成熟的MMP2。因此，構建一個可評價MMP2和MT1-MMP的蛋白水解活性的分子成像策略將有助于預測腫瘤的惡性程度。
　　目的：構建一個可評價腫瘤的MMP2和MT1-MMP的蛋白水解活性（代表腫瘤的惡性程度）的分子成像系統(tǒng)，并對其進行效果評價。
　　方法和結果：1、在本研究中，通過基因重組、轉(zhuǎn)化、擴增和純化質(zhì)粒，我

3、們首先構建了一個全新的基于蛋白質(zhì)水平的熒光探針，它可以特異性地標記在MMP2和MT1-MMP陽性的細胞表面上。此探針由4個結構域構成：①谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合蛋白結構域，也被稱為抑制結構域(Inhibitory[I]-domain)，它可以抑制TM-結構域的跨膜活性。②MMP2和MT1-MMP的特異性多肽底物，也被稱為分裂結構域（Cleaved[C]-domain），它是MMP2和MT1-MMP蛋白裂解探針的酶切位點。③表皮生長因子受

4、體跨膜區(qū)，也稱跨膜結構域（Transmembrane[TM]-domain），以跨膜形式有效結合在MMP2和MT1-MMP陽性細胞的細胞膜上。④DsRed2紅色熒光蛋白結構域（Fluorescent[F]-domain）。
　　2、為證實構建的探針是否可以鑒別細胞的MMPs活性，我們從離體和在體兩個方面進行了驗證。離體實驗中，人纖維肉瘤細胞HT1080（高表達MT1-MMP和MMP2）和熒光探針（10μg/mL）共同培養(yǎng)24小時，

5、同時加入或不加入10μg/mLGM6001（MMPs的抑制劑），PBS洗凈，熒光顯微鏡觀察，同時測定細胞膜表面的熒光強度。結果表現(xiàn)為：①熒光顯微鏡下，GM6001(+)組HT1080細胞無可見紅色熒光，而GM6001(-)組HT1080細胞發(fā)射出強紅色熒光。②熒光強度的定量試驗中，GM6001(-)組細胞的熒光強度為GM6001(+)組細胞熒光強度的23.3倍。此定性和定量結果說明：在MMP2和MT1-MMP作用下（GM6001(-)組

6、），熒光探針的Cdomian發(fā)生蛋白水解，探針被分裂為兩部分，釋放的TM-F片段經(jīng)由跨膜區(qū)（TM-domain）結合于HT1080細胞的細胞膜的表面，HT1080細胞釋放紅色熒光（DsRed2）；而在MMP2和MT1-MMP活性被抑制時（GM6001(+)組），熒光探針C-結構域的蛋白水解作用被抑制，探針保持完整，探針的跨膜區(qū)活性被抑制，故在熒光顯微鏡下，細胞表面無可測紅色熒光。
　　3、在體實驗，①HT1080細胞的皮下荷瘤小鼠

7、模型的構建：注射1×106（在100μlPBS中）個對數(shù)生長期的HT1080單細胞懸液至BALB/cnu/nu免疫缺陷小鼠右后肢皮下，待腫瘤長至150mm3時備用。尾靜脈注射10nmol純化探針至此HT1080細胞皮下荷瘤小鼠，利用IVIS-200實時光學成像系統(tǒng)，在探針注射后0、12、24小時檢測小鼠全身的熒光強度。結果表現(xiàn)為：注射后0h，小鼠全身都發(fā)射出熒光，接著，這些熒光強度顯著下降直至消失；但是，在移植瘤部位從注射后0h直至注射

8、后24h依然可以檢測到熒光發(fā)射。這一結果說明：在移植瘤上，探針被劈開為兩個片段，并且以MMPs依賴性的方式保留在移植瘤中。②MT1-MMP陽性和MT1-MMP陰性細胞的皮下荷瘤小鼠模型的建立：分別注射1×107（在100μlPBS中）個對數(shù)生長期的MT1-MMP陽性和MT1-MMP陰性細胞的單細胞懸液至BALB/cnu/nu免疫缺陷小鼠右后肢皮下，待腫瘤長至150mm3時備用。靜脈注射10nmol的探針至小鼠體內(nèi)，注射后24小時顯像，結

9、果為：MT1-MMP（+）組小鼠的移植瘤的單位體積熒光強度為83000光子/mm3，而MT1-MMP（-）組小鼠的移植瘤的單位體積熒光強度僅為9100光子/mm3。這一結果進一步說明探針在MMPs存在下，探針被激活并發(fā)射熒光。③筆者進一步在腫瘤的微環(huán)境水平上（利用OV-100在體光學實時成像系統(tǒng)）檢測HeLa細胞的皮內(nèi)荷瘤小鼠模型中移植瘤的浸潤前沿上DsRed2的表達。HeLa細胞皮內(nèi)荷瘤小鼠模型的構建：注射1×103（在100μlPB

10、S）個處于對數(shù)生長期的HeLa單細胞懸液至BALB/cnu/nu免疫缺陷小鼠右腹側皮內(nèi)，待腫瘤長至300mm3備用。靜脈注射10nmol探針至小鼠體內(nèi)，OV-100光學成像系統(tǒng)實時觀察。結果表現(xiàn)為：在高表達MMP2的腫瘤侵潤前沿，DsRed2高表達，且在高表達MMP2的腫瘤的血管形成區(qū)域，DsRed2亦高表達。這一結果進一步證實此探針可以成功鑒別細胞的MMPs活性。
　　結論：綜合以上實驗，本研究成功構建了一種基于蛋白水平的熒光探